HPV原位杂交技术的应用体会(浙江省肿瘤医院病理科310022)【关键词】原位杂交；人乳头状瘤病毒；探针【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2015)35-0078-02宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌居第2位的恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。作为目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)的持续感染相关［1］。HPV病毒是一种环状双链DNA病毒，具有球形外壳，直径55nm,长约8kb［2］。主要感染皮肤粘膜上皮，导致不同病变。目前已经鉴定的HPV病毒超过200种［3］,至少50种与生殖道粘膜感染相关。依据不同型HPV与癌发生的危险性高低分为低危险型HPV如HPV6,11等，常引起外生殖器湿疣等良性病变括宫颈上皮内低度病变(CINI);高危险型HPV如HPV16,18,31,33等与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/CINIII)的发生相关，尤其是HPV16、18型。因此，高危型HPV检测具有很高的临床意义。目前HPV-DNA病毒学检测的方法很多，包括：免疫组化(IHC),杂交捕获(HC),原位杂交(ISH),聚合酶链式反应(PCR傳。比较而言，在临床病理学中HPV检测的原位杂交技术具有较大的优势。现将实验中的操作体会与大家共同探讨。1.材料与方法1.1材料拟行HPV原位杂交的活检标木，经10%中性缓冲福尔马林固定，常规组织处理，4微米连续切片粘附于APES或多聚赖氨酸涂胶片上，65°C烤箱烤片备用。HPV高危型、低危型试剂盒购自正规试剂公司。苏泊尔不锈钢压力锅(18cm),电磁炉，柠檬酸盐抗原修复液(Citrate缓冲液),PBS缓冲液。1.2方法：---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1.2.1脱蜡至水包括：⑴二甲苯：10分钟×2〜3次。（2）100%乙醇：2分钟。（3）95%乙醇：2分钟。（4）80%乙醇:2分钟。（5）70%乙醇：2分钟。（6）双蒸水：2分钟×3次。1.2.2加热预处理：（1）电磁炉压力锅煮片（压力锅喷气后计时1〜3分钟），或微波炉高火15〜30分钟（2）双蒸水洗片：2分钟×3次。1.2.3梯度乙醇脱水包括：（1）70%乙醇：2分钟。（2）80%乙醇：2分钟。（3）95%乙醇：2分钟。（4）100%乙醇：2分钟。（5）100%乙醇：2分钟。（6）室温干燥20分钟。1.2.4组织、探针变性和杂交：（1）杂交膜中央滴加15〜20μl的探针。（2）将加有探针的杂交膜轻盖在组织上避免产生气泡。（3）封片胶密封杂交膜边缘。（4）玻片置原位杂交仪或PCR仪95"C变性5〜10分钟后37°C孵育过夜（至少超过12小吋）。（5）严格洗涤。（6）杂交后，小心去除封片胶和杂交膜。（7）0.5×SSC洗涤液（50%的甲酰胺及枸橼酸盐）,室温下片刻。（8）0.5×SSC洗涤液，75°C5分钟（每多加一张切片，温度提高1度，最高不超过80°C）。（9）双蒸水冲洗2分钟×3次。1.2.5免疫显色：（1）3%H2O2甲醇溶液：10分钟。（2）l×PBS/Tween20（0.025%）冲洗：2分钟×3次。（3）切片滴加抗DIG（地高辛）抗体:室温孵育40〜60分钟。（4）l×PBS/Tween20（0.025%）冲洗：2分钟×3次。（5）滴加两HRP-IgG抗体:室温孵育30〜40分钟。（6）l×PBS/Tween20（0.025%）冲洗：2分钟×3次。（7）DAB显色：2〜10分钟（镜下观察）。（8）自来水冲洗2分钟。1.2.6复染与封片：（1）苏木素复染：5秒〜5分钟（具体吋间因组织不同而异，复染过深会使阳性信号变得模糊）。（2）自来水冲洗：2分钟。1.2.7梯度脱水：（1）70%乙醇：2分钟。（2）80%乙醇：2分钟。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---（3）95%乙醇：2分钟。（4）100%乙醇：2分钟。（5）100%乙醇：2分钟。（6）二甲苯透明：2分钟×2次。（7）中性树胶封片。2.结果判读阳性上皮细胞核呈棕褐色或棕黄色。HPV感染的细胞形态主要包括：核周空穴细胞（“挖空细胞”），角化不良细胞，湿统样外底层细胞。将DNA检测结果与细胞及核形态学联系起来，可以区分弥漫型和颗粒型阳性信号，HPV整合状态呈颗粒型；HPV游离状态呈弥漫型。3.讨论近年来随着分子检测技术的发展，我们可从分子的水平更早期的、更准确地，检测出低拷贝数下的病毒感染情况［4】。该技术0前...