第24卷,第5期光谱学与光谱分析2004年5月SpectroscopyandSpectralAnalysisVol124,No15,pp5962599May,2004时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究郭周义,田振,贾雅丽华南师范大学激光生命科学研究所,广东广州510631摘要时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物,标记蛋白质、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲合反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等发生后,用时间分辨荧光技术测定反应体系中分析物的浓度,的。它之所以能够继放射性同位素标记、酶标记、化学发光、更灵敏的检测方法,3+命荧光团Eu螯合物的光谱研究结果,:336～337nm3+的激发波长,有利于Eu主题词免疫分析;;Eu3+螯合物:A:100020593(20040520596204111f—f跃迁光谱引言最近几年发展起来的时间分辨荧光免疫分析方法(TR2FIA是超微量免疫检定法的一大突破。由于使用了时间分辨光谱技术和荧光增强技术,使荧光免疫分析的灵敏度得到了极大提高。1983年Petterson[1]和Eskola[2]首先将时间分辨荧光光谱技术应用于免疫分析的研究中。目前,TRFIA的最低检出值已达10-19mol・well-1,远远超过酶标记免疫分析法(EIA的10-9mol・well-1,放射免疫分析法(RIA的10-15mol・well-1和发光免疫分析法(LIA的10-15mol・L-1。稀土离子是金属离子,若用来直接标记抗原、抗体,标记率很低,一般使用含有双功能基团的螯合剂,形成稀土离子2螯合剂2抗原(或抗体的螯合物。稀土离子的荧光,不仅与自身的能级结构有关,而且与螯合剂的性质有关。螯合物不同,稀土离子的激发光和发射光也会有所不同。指fn组态内,不同J能级间跃迁所产生的光谱。它的特点是:(1发光弱。这主要是因为f—f跃迁是宇称选择规则禁1稀土离子的吸收光谱镧系离子的电子排布为21s2s22p63s23p63d104s24p64d104fn5s25p6(n=0～14,其主要价态有二价、三价和四价。三价态是特征氧化态,其n基组态是4f(n=0～14,下一个激发态是4fn-15d[3]。稀土离子吸收光谱[4]的产生可归因于三种情况。收稿日期:2003203226,修订日期:2003206228阻的。虽然在溶液和固态化合物中,由于配体场微扰,也能观察到相应的光谱,但相对于d—d跃迁来说,也是相当弱的。(2类线性的光谱。谱带的尖锐原因是处于内层的4f电子受到5s2,5p6电子的屏蔽,受环境的影响较小。(3谱带的范围较广。在近紫外,可见区和近红外区内的光谱。都能得到稀土离子(Ⅲ112f—d跃迁光谱4fn向4fn-15d的跃迁是组态间的跃迁。这种跃迁是宇称选择规则允许的,因而4f—5d的跃迁是较强的;三价离子的吸收带一般在紫外区出现;由于5d能级易受周围离子的配体场影响,相对于f—f跃迁来说,谱带变宽。113电荷跃迁光谱稀土离子的电荷跃迁光谱,是指配体向金属发生电荷跃迁而产生的光谱,是电荷密度从配体的分子轨道向金属离子轨道进行重新分配的结果。镧系络合物能否出现电荷跃迁带取决于配体和金属离子的氧化还原性。一般在易氧化的配体3+3+和易还原为低价离子(Sm,Eu,Te3+,Yb3+和Ce4+的络合物光谱中易见到电荷跃迁带。谱带的特点是有较强的强度和较宽的宽度。基金项目:广东省科技攻关重点项目(2002C60113;广州市天河区科技计划项目(2002XGP06;广东省自然科学基金项目(No1015012,No.031518;教育部科学技术研究重点项目(No102113资助作者简介:郭周义,1965年生,华南师范大学激光生命科学研究所教授,博士生导师301,23415,292,189nm。2稀土离子的荧光性能211稀土的荧光光谱在紫外线等高能射线的激发下,处在溶液或化合物中的三价稀土离子被激发,从基态跃迁到激发态,然后再从激发态返回到能量较低的能态时,放出辐射能而发光,这种光即为荧光。稀土离子的荧光光谱也像吸收光谱一样,来自三个方面的跃迁:f—f跃迁;5d—4f跃迁;电荷转移跃迁。当一些络合物的配体不吸收紫外光时,其荧光的产生,可通过电荷跃迁或4fn-4fn-15d跃迁至相应的激发态,再以非辐射衰变至4fn组态的激发态,此激发态向低能态跃迁时,也可产生荧光。212紫外线激发产生荧光的物理过程[4]络合物荧光的能量跃迁过程,一般可分三步来说明(跃迁过程见图1:(1先由配体吸收辐射能,从单重态的基态S0跃迁至激发态S1,其激发能可以辐射方式回到基态S体荧光,或T2;(2...