大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养邹瑾1李雅2尹进3(1湖南科技职业学院湖南长沙410014)(2湖南中医药大学湖南长沙410004)(3湖南疾病预防控制中心湖南长沙410007)【摘要】目的:探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法：釆用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3〜4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CDllb、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8〜10天可达80%〜90%融合，纯化后传代周期为6〜8天。流式细胞术鉴定表明CDllb和CD45阴性，CD90阳性。结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠【】R730.5【文献标识码】A【】2095-1752(2015)13-0026-02RatbonemarrowmesenchymalstemcellssseparationmethodsandtocultivateZou激n.HunanVocationalCollegeofScienceandTechnology,HunanProvince,Changsha410014,China;LiYa.HunanUniversityofChineseMedicine,HunanProvince,Changsha410004,China;Yin激n.TheCentersforDiseaseControlandPreventionofHunan,HunanProvince,Changsha410007,China【Abstract】ObjectiveToexploretheinvitrocultureandpurificationofSDratbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)method.MethodsUsingimprovedthewholebonemarrowadherentmethod,separationandpurificationofrat(for3〜4weeks)ofBMSCs,microscopicallycontinuousobservationofcellmorphologychange.ToidentificationcellssurfaceantigenCDllb,CD45andCD90expressionusingflowcytometry.ResultsTheoriginalgenerationofculturedcellsiscircularandspindle,after24hours,mostofthecellsareattached.8〜10dayslater,thefusionofupto80%〜90%.Afterpurification,extendtheperiodis6〜8days.Usingflowcytometryassay,CDllbandCD45werenegative,CD90ispositive.ConclusionsImprovedthewholebonemarrowadherentmethod,whichcaneffectivelytheisolationandcultureofratbonemarrowmesenchymalstemcells,isanidealmethodofcultivation.【Keywords]Bonemarrowmesenchymalstemcells;Cellculture;Therat骨髓间充质干细胞是中胚层的干细胞，是具奋多向分化潜能的成体干细胞之一[1】。在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞，还可以跨胚层分化为神经元、肝细胞和内皮细胞等，是0前组织工程的重点种子细胞。分离培养高纯度和高活力的BMSCs是组织工程的关键。本实验B的在于采用改良全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行分离培养，为组织工程技术提供种子细胞。1.材料与方法1.1材料雄性SPF级SD大鼠，5〜7周，体重110plusmn;20g，购自湖南中医药大学动物实验中心。L-DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）。PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶（Sigma公司），EDTA二钠（上海生物工程有限公司），FITC标记CDllb、CD90、CD45抗体（Serantec公司）等。1.2方法1.2.1原代培养BMSCs将经过高压火菌的手术器械准备好，大鼠采取颈椎脱闩法处死后，放在75%的酒精中浸泡10分钟。在无菌的环境下，快速取出大鼠的股骨、胫骨，并剔除其周围的组织，然后切除大鼠的股骨、胫骨的两端。使用5mL剂量的注射器，抽取DMEM液，给大鼠的骨髓腔进行反复冲洗，然后把冲洗液收集起来，放在离心管里，1500转/分，离心5分钟后将上清液丢弃。放进有15%的胎牛血清的DMEM培养液中，反复吹打，经过细胞计数之后，按照109/mL的密度，在50cm2的培养瓶里接种，放置温度在37摄氏度、湿度饱和、体积分数是0.05的C02的培养箱里，进行培养。使用倒置的显微镜，进行日常观察其细胞的生长状态。48个小时之后开始换液，并丢弃未贴壁的细胞，之后每隔两天进行一次换液。1.2.2传代、纯化BMSCs当原代培养的细胞增殖，能够在瓶底的融合情况大致到达80%左右时，用0.25%浓度和0.01%浓度的EDTA混合消化酶，进行细胞消化，使用奋15%的胎牛血清的培养基进行消化反应的终止处理，然后使用吸管，进行轻轻的吹打，让细胞能够完全脱壁，再将其放入离心管里...