大鼠的视觉通路【ERK信号通路在癫痫大鼠海马中的激活及托吡酯的保护作用】[摘要]目的：采用氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠实验模型，研究急性致痫大鼠海马中ERK蛋白及下游NF-κB的活性改变，并观察托吡酯（TPM）的干预作用。方法:取健康wistar大鼠36只，随机分成5组，对照组，氯化锂-匹罗卡品处理组和三个剂量的TPM组。应用免疫印迹法检测海马组织中ERK蛋白磷酸化及下游NF-κB蛋白表达的变化，并观察TPM干预后的行为学改变。结果：(1)急性癫痫发作后0.5h,除对照组外各组大鼠海马组织中磷酸化ERK及活化NF-κB水平均升高；（2）发作2.5h后，处理组大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平均下降，但仍高于正常水平；而TPM中剂量及高剂量干预组中大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平明显高于低剂量组及处理组结论：ERK通路在大鼠癫痫急性发作的海马体中能被激活，自第1页共5页发保护神经元细胞阻止凋亡，NF-кB参与此过程；而托吡酯能将激活的持续时间延长，激活的后续水平提高，这可能是TPM保护作用的重要机制。关键词:癫痫；ERK；NF-κB；托吡酯中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1004-7484（2012）06-0100-03作为神经系统的常见疾病之一，癫痫在我国的发病率已超过7‰,目前研究表明，癫痫的发生于离子通道、神经胶质细胞及神经递质都有密切关系[1]。现有的药物已能在很大程度上控制癫痫的急性发作，但是癫痫反复发作后会造成一定程度脑损伤，导致神经元凋亡以及功能失调，尚不能完全解决[2]。托吡酯(TPM)是由氨基磺酸酯取代单糖的新型抗癫痫药物，能通过切断钠通道，提高GABA激活受体的频率。有研究表明，TPM还具有保护神经元作用，其机制尚未明确[3]。本实验通过复制急性第2页共5页癫痫大鼠模型，并通过观察癫痫大鼠行为学，探讨TPM的干预作用，最后通过免疫印迹法，观察ERK蛋白的磷酸化及下游NF-κB蛋白表达的变化，进一步探讨TPM对神经元的保护作用的可能机制，为其临床应用提供实验依据。1材料与方法1.1实验分组给药及癫痫模型的制备健康清洁级成年wistar大鼠实验36只，雌雄不限，体重(200±30)g,实验分组见表1组别n给药方式对照组5腹腔注射5ml生理盐水氯化锂―匹罗卡品组(处理组)6腹腔注射氯化锂3mmol/kg,24小时后注射30mg/kg匹鲁卡品TPM低剂量组7腹腔注射TPM20mg/kg，第3页共5页1h后腹腔注射氯化锂3mmol/kg,24小时后注射30mg/kg匹鲁卡品TPM中剂量组7腹腔注射TPM40mg/kg1h后腹腔注射氯化锂3mmol/kg,24小时后注射30mg/kg匹鲁卡品TPM高剂量组7腹腔注射TPM80mg/kg1h后腹腔注射氯化锂3mmol/kg,24小时后注射30mg/kg匹鲁卡品1.2行为学观察腹腔内注射后连续观察大鼠行为,并记录癫痫发作的潜伏期、发作程度和持续时间,参考Racine分级标准[4]。1.3取材及核蛋白提取及蛋白样本制备发作后0.5h，将中剂量TPM干预组中4只及处理组中3只大鼠予戊巴比妥钠(80mg/kg)深麻醉,迅速断头、咬开颅骨、剥第4页共5页出双侧海马；发作后2.5h，照以上方法处死剩余动物并取材。组织核蛋白提取试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，将组织匀浆后按试剂盒要求提取核蛋白。1.4westernblot检测ERK磷酸化水平和NF-κB蛋白活化用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，含5%脱脂奶粉的PBS封闭液封闭1h后加入一抗，4oc孵育过夜，洗膜后加入荧光素标记的二抗37oc孵育1h。采用GAPDH作为内参，用LI-COROdyssey进行荧光显色并计算条带灰度值。实验均重复至少3次。1.5统计学处理运用SPSS10.0软件，进行单因素方差分析，显著性水平P第5页共5页