用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究兽医科技收稿日期:2022-12-21;修回日期:2022-10-31基金项目:中国农科院兰州畜牧与兽药研究所基金项目(MYJJ05-3)作者简介:魏小娟(1976-),女,助理研究员,硕士.用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究魏小娟,张继瑜,张梅,李剑勇,周绪正,李金善,牛建荣(中国农业科学研究院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药重点开放实验室,甘肃兰州730050)中图分类号:S852.4+3文献标识码:B文章编号:1014-7034(2022)01-0065-02关键词:伊维菌素;人工抗原;多聚-L-赖氨酸摘要:采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法,将伊维菌素(IVM)分别与多聚-L-赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA)连接制备人工免疫原5-O-(单)琥珀酰IVM-PLL和包被原5-O-(单)琥珀酰IVM-OVA,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实人工抗原合成成功。伊维菌素(Lvermectin,IVM)是大环内酯类杀虫、杀螨剂,由于其具有杀菌活性强以及杀菌谱广等特点已被广泛地应用于畜禽及水产养殖业,也是农业生产上广泛使用的一种杀虫剂。但此类药物在动物性产品中的残留严重影响到我国农产品的国际竞争力,同时也对人及环境存在潜在的威胁。随着人们对IVM残留的毒性及环境风险的日益关注,迫切需要简单、快速、高效的IVM残留检测方法,但目前常用的HPLC法检测的灵敏度较低,无法满足农产品中IVM及其有毒代谢物的残留分析要求。为此,笔者根据IVM的结构特点,采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法将伊维菌素与载体蛋白偶联,成功地制备了伊维菌素完全抗原,为畜禽产品中伊维菌素残留的ELISA检测奠定了基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1伊维菌素白色粉末,有效成分含量>101%(其中B1a含量约为92%,B1b含量约为18%),浙江海正药业有限公司提供。1.1.2主要试剂牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、多聚-L-赖氨酸(PLL)、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC),Sigma公司产品;二甲基甲酰胺(DMF)、咪唑、琥珀酸酐、吡啶,北京化工厂生产;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、叔丁基二甲基氯硅烷(t-BuMe2Si-Cl),天津化学试剂公司生产;硅胶GF254(200~400目),青岛海洋化工厂生产;羊抗兔IgG-HRP,北京鼎国生物公司生产。1.1.3主要仪器透析膜(Sigma)、Sartorious电子天平、95-1型磁力恒温搅拌器、DDY-6B型电泳仪、凝胶成像系统及分析软件(Syngene公司)。1.1.4试验动物新西兰成年白兔,体重1.7~2.0kg,购自中牧集团兰州生物制药厂。1.2试验方法1.2.1半抗原5-O-(单)琥珀酰IVM的合成以C5-OH为反应位点,在无水吡啶的催化下进行反应。取0.1gIVM加2.0mL无水吡啶溶解,加入0.05g琥珀酸酐,45e、磁力搅拌下避光反应12h,反应物在3.6%HCl和乙酸乙酯间分配,收集酯层减压浓缩;用二氯甲烷复溶残留物,TLC分离产物(GF254,展开剂CH2C12BTHFBHAC(90B9.5B0.5),共有4个条带,Rf分别为1.0,0.5,0.3,0.2;分别刮取4条带,以乙酸乙酯淋洗,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥。1.2.2人工抗原的合成免疫抗原5-O-(单)琥珀酰IVM-PLL的合成(NHS法):取12mg半抗原5-O-(单)琥珀酰IVM,加0.4mLDMF溶解,再依次加入2.7mgNHS和4.7mgEDC-HCl混合,20e避光搅拌10h,将上述反应液逐滴加至6mL含20mgPLL的硼酸盐缓冲液(0.2mmol/L,pH值为9.4)-10%DMF;溶液开始略显混浊,最后有少量沉淀出现,继续搅拌1h,再转至4e条件下搅拌12h,产物经PBS(0.01mol/L,pH值为7.2)透析73h,SephdexG-200纯化。包被原5-O-(单)琥珀酰IVM-OVA的合成(混合酸酐法):取10mg5-O-(单)琥珀酰IVM,用1mLDMF溶解,加入15LL氯甲酸异丁酯,20e搅拌45min,制成A液;称取30mg的OVA溶于10mL0.2mol/mL硼酸盐缓冲液(pH值为9.4)中制成B液。将A液逐滴加入B液,边加边搅拌,之后在4e搅拌反应12h,然后将混合物装入事先处理并在0.01mol/mLPBS(pH值为7.4)中浸泡过夜的透析袋中,在4e、0.01mol/mLPBS(pH值7.4)中透析3d,每天换2次透析液。1.2.3半抗原和人工抗原的结构鉴定半抗原的结655黑龙江畜牧兽医62022年第1期兽医科技收稿日期:2022-12-21;修回日期:2022-10-31基金项目:中国农科院兰州畜牧与兽药研究所基金项目(MYJJ05-3)作者简介:魏小娟(1976-),女,助理研究员,硕士.用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究魏小娟,张继瑜,张梅,李剑勇,周绪正,李金善,牛建荣(中国农业科学...