叶颖宝萤火虫荧光素酶的原核表达3120100213摘要：荧光素酶（相对分子质量为63000左右）是生物体内催化荧光素氧化发光的一类酶的总称。荧光素酶可以从发光细菌、萤火虫、发光海星和发光甲虫等多种发光生物中提取出来。萤火虫荧光素酶在有02、Mg2+、ATP存在的条件下，催化肛荧光素氧化脱羧，将化学能转化为光能，并释放出光量子，发出绿光，其反应可表示为：LH2+ATP(Mg2+)+O2→LO+CO2+PPi+AMP+hv1985年，Jeffery等人首次克隆了萤火虫荧光素酶基因，并在E．coli中成功表达，从中得到具有活性的荧光素酶，随后各种发光甲虫的荧光素酶基因相继克隆成功，并能在原核和真核表达系统中成功表达。与常规方法比较，利用基因工程菌发酵生产具有周期短、成本低、过程易于规范控制等诸多优点，且由于发酵培养基成分简单、虫光素酶基因可受启动子基因调控，使其具备易纯化和可诱导高产的特点。因此利用基因工程菌发酵生产萤火虫荧光素酶成为国内外学者研究的热点。实验目的：掌握DNA的提取，质粒载体的构建，导入等基本的基因工程的实验操作。并了解蛋白质的提取，蛋白酶活性的检测方法。以荧光虫荧光素酶报告载体pXP2DNA为模板，扩增得到编码萤火虫荧光素酶(LUC)的基因(1uc)，构建了诱导型表达栽体pQE30-luc。将载体导入E．coliM15获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15／pQE30-1uc。实验原理：根据NCBI中pXP2载体中编码萤火虫荧光素酶基因lucDNA序列，设计引物。碱基序列为：1atggaaacggaaagggaggaaaatgttgtatatggccctctgccattctaccccattgaa61gaaggatcagctggaattcagttgcataagtacatgcaacaatatgccaaacttggagca121attgcttttagtaacgcccttactggagtggatatttcttaccaacaatactttgatatt181acatgtcgtttagctgaggcaatgaaaaactacggtatgaaaccggaaggacatattgct241ttgtgcagtgaaaattgtgaagaatttttcatccctgtgcttgctggtctttacattgga301gtaactgtcgcacctactaatgaaatttacacattgcgtgaacttaatcacagtttgggc361atcgcacaaccaactattgtattcagctccagaaaaggcttacctaaagttttagaagtg421caaaaaacagttacatgcatcaaaacaattgttattttagatagtaaagtaaactttgga481ggctacgattgtgtggaaacttttattaagaaacatgtagaattaggttttccagcaact541agctttgtacccattgatgtaaaggaccgtaaacatcacattgctttgcttatgaattct601tctggctctactggtttacctaaaggtgtagagattacccacgaaggaacagttacaaga661ttctcacacgctaaggatccaatttacggaaaccaagtttcacctggtactgctatttta721actgtcgttccgttccatcatggatttggaatgtttaccactttaggatactttgcttgt781ggataccgtattgtaatgttaacaaaattcgatgaagaactatttttgagaactttgcaa841gattataagtgtaccagtgttattcttgtaccaacgttatttgctattctcaacaggagt901gaattgctcgataagttcgatttatctaatctaactgaaattgcttctggtggagctcct961ttggcaaaagaaattggtgaagcagtcgctagaagatttaatctacccggtgtccgtcag---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1021ggttacggattgacagaaacgacatctgcatttattattaccccagaaggtgatgataaa1081cctggagcatctggaaaagtagtacccttattcaaagtaaaaattattgatcttgacact1141aaaaaaactttgggtgtcaaccgacgaggagagatctgtgtaaaaggtccgagtcttatg1201ttaggctacacaaacaatccggaagcaacaagagaaactattgatgaagagggttggttg1261cacaccggagatattggatattacgacgaagacgaacatttcttcattgtagatcgtttg1321aaatcattaatcaaatacaaggggtaccaggtaccacctgctgaattggaatccgttctt1381ttgcaacatccaaatatctttgatgctggtgtggctggtgtccccgattctgaagctggt1441gaacttccaggggctgtagttgtaatggaaaaaggaaaaactatgactgaaaaggaaatt1501gtggattatgttaatagtcaagtagtgaaccacaaacgtctgcgtggtggcgttcgtttt1561gtggatgaagtacctaaaggtctaactggtaaaattgatgctaaagtaattagagaaatt1621cttaagaaaccacaagccaagatgtaa引物为：上游：5'-CGCGGATCCATGGAAGACGCCAAAAAC-3‘(BamHI)下游：5-’CGCAAGCTTTTACAATTTGGACTTTCCG-3‘(HindHI)然后提取出此基因，转入质粒并导入大肠杆菌中，检测其表达。实验过程与方法：①采用LB培养基，培养温度为37℃，摇床转速200r／min，氨苄青霉素质量浓度为100ug／mL，卡那霉素质量浓度为50ug／mL，以体积分数2％的接种量转接，相同培养条件下，...