2011年第2期植物检疫PLANTQUARANTINE单条线虫DNA提取方法Vol．25No．2王江岭1张建成2顾建锋1*（1．宁波出入境检验检疫局技术中心浙江宁波315012；2．嘉兴出入境检验检疫局）MethodofextractDNAfromasinglenematode．WangJiangling1，ZhangJiancheng2，GuJianfeng1*（1．Ning-boEntry－exitInspectionandQuarantineBureau，Ningbo315012，China；2．JiaxingEntry－exitInspectionandQuarantineBureau）AbstractTherearemanyproblemsinextractingDNAfromlargenumberofnematodes．Thenematodescouldbeamixedspecie．TheextractedDNAweredecreasinginexperimentprocess．Amplificationmightbecumberedbyaddingmoresolutes，andeventoeffectonthenextexperiments．Inthismethodasinglenematodewasfreezedbyliquidnitrogenandheatedat85℃todisruptethestructureofnematodecellsbychangingthetemperaturesudden-ly．ThentheproteinsweredissolvedeasilybyproteinaseKandmoreDNAwereextracted．Thismethodwasprovedeffective，rapid，andstabilebykindsofnematodes．Theadvantagesofthismethodare：（1）PCRBufferattachedtoTaqenzymetaketheplaceofWLBandSDSlysisliquids，whichreducestheinstabilityofreactionsys-temandtheeffectofaddedsolutes．（2）AlltheprocessisfinishedinonePCRtube，noliquidtransportedandlesssolutesadded．SothepollutionandbadeffecttothelaterPCRprocessaregreatlyreduced．（3）Manualdis-ruptionofnematodeisreplacedbypoikilothermictreatment；pollutionisavoidedandnoexperimenttechniqueisrequired．ComparedwithtwootherproteinaseKmethodsofnematodeDNAextraction，thismethodwasprovedef-fectiveandstabile，andcouldbeusedinrapidtest；nematodeproteinsweredissolvedcompletelyandmoreDNAreleased，thePCRresultisgoodevenwhentheextractedDNAweredilutedfor32time，whichprocidesmoremo-lecularexperimentschances．Keywords摘要nematode；optimizedmethod；DNAextraction；proteinaseK；temperature大量线虫DNA的提取可能因线虫不纯而受到污染，溶液多次转移造成DNA损失，并且在提取过程中加入过多的溶质离子也可能对PCR扩增有干扰，从而影响下一步的研究。本研究用液氮快速冷冻单条线虫，继以85℃快速变温，用温度的剧烈变化使线虫裂解，再以蛋白酶K降解蛋白质，提高了获得的DNA的纯度和数量。通过多种线虫的验证试验表明，该方法高效、快速、稳定。该试验方法有如下优点：（1）使用Taq酶附带的PCRBuffer代替WLB裂解液和SDS裂解液，减少了配置的不确定性和外来离子的影响。（2）整个提取过程在一个PCR管中完成，并可直接用于PCR扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---试用碱裂解法加，减少污染和对后续PCR的影响。（3）使用变温处理代替其他手工破碎方法，减少了外界污染物的掺入，不需要手工操作技巧。与另外2种提取线虫DNA的蛋白酶K方法相比，本研究提取单条线虫DNA的时间短，效率高，PCR扩增结果稳定可靠，符合快速检测的需求；此外，本研究所使用的方法降解单条线虫蛋白质彻底，提取DNA数量多，稀释32倍仍能扩增出明显的条带，可进行多次分子试验研究。关键词线虫；DNA提取；方法优化；蛋白酶K；温度；中图分类号S763由于线虫体形较小，形态学鉴定十分困难，分础是单条线虫DNA提取。近年来，许多学者曾尝子生物学方法已成为十分有效的辅助手段，而其基［1－3］、蛋白酶K法［4－9］、试剂盒法［10］基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技项目（2010IK269）；宁波市农业科研攻关合作项目（2008C10014）；宁波市自然科学基金项目（2010A610018）通讯作者：E－mail：gujf@nbciq．gov．cn收稿日期：2010－10－13—32—---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---2011年第2期植物检疫PLANTQUARANTINEVol．25No．2等进行单条线虫DNA提取，但存在实验时间长、所用试剂多、价格贵、结果不稳定等问题。本实验室11．1材料与方法...