反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用【摘要】目的构建反义GFAP逆转录病毒表达载体，评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞(Ast)形态及GFAP基因表达的影响。方法用定向克隆技术，将1.1kb的GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN上，获得重组体PLBskG，经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等，挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养，收获病毒上清液感染体外培养的Ast，通过免疫组织化学、原位杂交、RT-PCR、Southernblot和流式细胞仪分析等方法，研究PLBskG对正常及损伤Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。结果插入PLBskG中的GFAPcDNA片段序列、方向完全正确，Southern杂交及RT-PCR分析表明，PLBskG成功整合入PA317细胞中，并实现了在NIH3T3细胞中的表达。PLBskG使正常及反应性Ast生长抑制，G1期阻滞，Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩，核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱；GFAPmRNA表达水平降低。结论获得了构建正确的反义GFAP逆转录病毒表达载体，并证实其对正常及反应性Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响，为深入研究Ast反应及GFAP基因的功能创造了条件。【关键词】星形胶质细胞；逆转录病毒；胶原纤维酸性蛋白；脑损伤【中分类号】Q189【文献标识码】A【】0529-1356(2000)02-102THECONSTRUCTIONOFANTISENSEGFAPRETROVIRUSEXPRESSINGVECTORANDTHEEFFECTONASTROCYTEHUANGQi-lin,ZHANGKe-cheng（DepartmentofNeurosurgery,XingqiaoHospital,）CAIWen-qin（theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China）【Abstract】ObjectiveTorecombinantantisenseGFAPretrovirusexpressingvectorandtoinvestigateitseffectonmorphologyandGFAPexpressionofnormal,reactiveastrocyte.MethodsA1.1kbfromthecodingregionofmouseGFAPgenewasclonedintheantisenseorientationtoPLXSN,aretrovirusvector.TherecombinantexpressingvectorwasnamedasPLBskG.TheefficiencyofPLBskGonthegrowth,cellcycle,morphologyandGFAPgeneexpressionofnormalandreactiveastrocyteinvitrowasinvestigatedbycellgrowthcurve,flowcytometerimmunocytochemistry,insituhybridization,RT-PCR,Southernblot.ResultsThesequenceandtheorientationofGFAPcDNAfragmentinsertedintoPLBskGwascompletelyaccuracy.ThePLBskGwassuccessfullyconformedintoPA317cellandexpressedinNIH3T3cellasshowedbySouthernblotandRT-PCRanalyze.ThePLBskGinfectionresultedingrowthsuppressionandG1stagearrestofthe---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---normalandscratchedastrocyte.ThenormalandreactiveastrocytesinfectedbyPLBskGbecameroundorellipse.Theprocessofthiscellbecamefineorretracted,theratioofnuclei/cytoplasmwaslarger.ThestainingofGFAPsubstancewasreducedandtranscriptionlevelofGFAPmRNAwasdown-regulated.ConclusionsWeobtainedanormalconstructionoftheantisenseGFAPretrovirusexpressingvector,andconfirmedthatthisvectorcouldeffectivelyinhibitthegrowthandGFAPexpressionofnormalandreactiveastrocyteinvitro.【Keywords】Astrocyte;Retrovirus;Glialfibrillaryacidicprotein;Braininjury星形胶质细胞(astrocyte,Ast)在中枢神经系统(CNS)中起着重要的作用，它不仅参与了CNS各种生理功能的调节，而且在CNS的多种病理变化中，尤其是在CNS的损伤修复中起着重要的作用。研究发现，胶原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)对维持Ast的形态结构及功能具有重要作用，抑制GFAP基因表达，可能影响Ast的生长、增殖，以及Ast对损伤的反应［1］。反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的，与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性的与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。本研究采用基因重组技术，成功构建了反义GFAP逆转录病毒表达载体，通过体外实验研究了其对培养正常及反应性Ast形态结构、GFAP基因表达的影响，并探讨了作用机制...