两种测定植酸酶酶活的方法比较及发酵条件研究徐丹丹赵邯郸王秀然关淑艳摘要：从富含有机质的环境中采集土样，通过植酸钙平板透明圈法初筛得到产植酸酶菌株，进而用钒-钼酸铵法和丙酮-磷钼酸铵法2种方法测定植酸酶酶活力，并进行比较。结果表明，钒-钼酸铵法为准确、可用的方法，通过正交试验确定了最适产酶发酵条件为pH5，可溶性淀粉用量1.25g/100mL，酵母粉用量1.80g/100mL，植酸钙用量1.0g/100mL。关键词：植酸酶;酶活;测定;钒-钼酸铵法;丙酮-磷钼酸铵法：Q93-332：A：0439-8114（2019）12-0134-04DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2019.12.031开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Abstract：Thesoilsamplewascollectedfromtheorganic-richenvironment，andphytaseproductionstrainswereobtainedbypreliminaryscreeningwithcalciumphytateplatetransparentringmethod.Thenphytaseactivitywasdeterminedbytwodifferentmethodsvanadium-ammoniummolybdatemethodandacetone-ammoniumphosphomolybdatemethod，andthencompared.Theresultsshowedthatthemethodofvanadium-ammoniummolybdatewasaccurateandavailable.TheorthogonalfermentationtestdeterminesthatpHis5，theyieldofsolubleenzymeis1.25g/100mL，theoptimumdosageofyeastpowderis1.80g/100mL，andtheamountofcalciumphytateis1.0g/100mL.Keywords：phytase;enzymeactivity;measure;vanadium-ammoniummolybdatemethod;acetone-ammoniumphosphomolybdatemethod植酸（肌醇六磷酸）及植酸盐广泛存在于植物体中，是植物磷的主要贮存形式，占植物中总磷的60%～80%[1]。但植酸磷难以被单胃动物吸收利用，随粪便排出体外会造成水体和土壤的严重磷污染[2]。同时，植酸及其盐还是一种抗营养因子，能与多种金属离子螯合并能与蛋白质等形成难溶的复合物，影响动物对矿质元素和蛋白质的吸收利用[3，4]。植酸酶能将植酸及其盐类降解为肌醇和磷酸（或磷酸盐），作为饲料添加剂可以提高植酸磷的利用率，提高植物性飼料的营养价值，减少畜禽粪便中磷的排放，减轻环境污染[5-7]。传统的产植酸酶菌株的筛选方法为透明圈法，该方法利用微生物在植酸酶筛选培养基上降解植酸钙，在菌落周围生成透明圈来初步判断微生物是否产植酸酶，但有些产酸菌株也能降解植酸钙产生透明圈，故平板透明圈法缺乏特异性和绝对性，必须再对产透明圈的菌株进行液体发酵培养，测定发酵液的植酸酶活性，才能判断出该菌株是否能够产植酸酶。植酸酶活性的测定方法较多，有钒-钼酸铵法、硫酸亚铁-钼蓝法、丙酮-磷钼酸铵法、微板法和微量比色法等[8]。本研究从土壤中粗筛出产植酸酶的菌株，通过钒-钼酸铵法和丙酮-磷钼酸铵法2种方法测定酶活力，确定最适宜本试验菌株的酶活测定方法，为后续试验奠定基础。1材料与方法1.1菌株试验菌株为前期实验室所筛产植酸酶菌株。1.2主要试剂植酸钠（P8810，Sigma公司）;植酸钙（阿拉丁试剂）;其余试剂均为分析纯。1.2.1丙酮-磷钼酸铵法丙酮-磷钼酸铵法测定酶活所需试剂如表1所示。1.2.2钒-钼酸铵法钒-钼酸铵法测定酶活所需试剂如表2所示。1.3主要设备721型分光光度计，PHS-3TC型精密数显酸度计，离心机。1.4方法1.4.1粗酶液的获得将实验室前期筛选的植酸酶菌株用马丁斜面进行活化，再从活化斜面取孢子接入4瓶盛有100mL液体发酵培养基的250mL摇瓶中，置于26℃、150r/min摇床发酵4d，过滤离心获得发酵上清液。1.4.2发酵条件的研究实验室前期已经筛选出最适碳源为可溶性淀粉，氮源为酵母粉。对二者用量进行发酵优化，以确定最佳碳氮源以及植酸钙用量，同时选出产酶最适的pH，发酵获得的粗酶液分别用2种方法进行酶活测定。1）可溶性淀粉用量。将淀粉按0.50、0.75、1.00、1.25、1.50g/100mL添加到发酵培养基中，确定其最佳用量。2）酵母粉用量。将酵母粉按1.4、1.6、1.8、2.0、2.2g/100mL添加到发酵培养基中，确定其最佳用量。3）植酸钙用量。调整培养基中植酸钙的用量，在培养基中分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0g/100mL，测定酶活，以确定植酸钙的最佳用量。4）初始pH筛选。调节培养基的初始pH，使其分别为1、...