融合PCR方法构建马尔尼菲青霉菌LIG4基因敲除载体王琳蓝秀万（通讯作者）（广丙医科大学广丙南宁530021）【摘要】目的构建马尔尼菲青霉菌（Penicilliummarneffei,PM）的UG4基因敲除载体，为敲除UG4基和后期构建PM高效打靶系统提供基础。方法通过PCR扩增UG4基因两翼基因片段及筛选标记基因pyrG基因片段，再用融合PCR方法扩增构建PMLIG4基因敲除载体，并酶切验证。结果用融合PCR成功构建了以pryG为筛选标记基因的PMLIG4基因敵除载体。结论马尔尼菲青霉菌UG4基因敲除载体构建成功，为进一步同源从组敲除PM的LIG4基因构建高效打靶系统提供基础。【关键词】马尔尼菲青霉菌融合PCRUG4基因【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）11-0099-02由马尔尼菲青■霉菌（Penicilliummarneffei,PM）是唯一温度依赖双相真菌青霉菌，引起人类系统性真菌感染性疾病，主要感染免疫缺陷患者，尤其是HIV感染者，易误诊，死亡率高[1],近年来其致病分子机制成为研究热点。利用同源从组方法敲除马尔尼菲青霉菌DNA修复关键基因UG4基因，可大大降低其非同源末端连接，从而提高同源重组效率[2],构建一个马尔尼菲青霉菌基因高效打靶系统，为其基因功能研究提供有效的遗传操作工只。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株及质粒：马尔尼菲青霉菌尿嘧啶营养缺陷菌株SPM4（实验室保存），大肠杆菌DH5α感受态细胞（TaKaRa公同），质粒pGEM-Teasy（Promega公司），含有pyrG基因质粒pLAX-223（实验室保存）。1.1.2主要仪器：SIGMA台式高速冷冻离心机（仪器型号：3K-15,生产厂家：德国SIGMA）,BIOMETRAPCR仪（仪器型号：Tpersonal,生产厂家：德---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---国BIOMETRA),英国UVI凝胶成像分析系统(型号规格：7600Z,生产厂家：日本奥林巴斯公司)。1.1.3主要试剂：Pfu酶(Takara),dNTP(Takara),Biospin胶回收试剂盒(BioFlux公司)，MaxiPCRclean-upkit(天根天根生化科技有限公司)，引物合成(上海生工生物工程有限公司)。1.2方法构建策略：设计引物，序列如下:LIG4-1F/LIG4-1R(5’-ACGGATGAGATCGTCGGGAC-3’/5’-GGACTTTGAGTGTGAGTGGAAATGTGTAACGGCAAAGGAGACTAGTCCAGGCAGCTATC-3/5’-CCGCAAGACGCTCACGCTTG-3’),LIG4-2F/LIG4-2R：(5’-TTGCCGTTACACATTTCCACTCAC-3’/5’-CGCAGACAATGCTCTCTATCC-3’),pyrG-F/pyrG-R(5’-TTGCCGTTACACATTTCCACTCAC-3’/5’—CGCAGACAATGCTCTCTATCC-3’)o扩增质粒pLAX-223的pyrG基因和菌株SPM4中UG4同源基因左右两翼基因UG4-1和LIG4-2,用融合PCR的方法合成(LIG4-1)-pyrG-(LIG4-2)敲除载体基因片段，转化进入大肠杆菌，蓝白斑筛选，电泳鉴定，酶切检验。1.2.1DNA分子操作SPM4菌总DNA提取、纯化，质粒pLAX-223DNA提取、转化方法菌参照文献［3】。1.2.2融合PCR融合PCR原理及过程如图1。第一轮：扩增UG4基因两翼基因LIG4-l,LIG4-2:LIG4-1F/LIG4-1R：,UG4-2F/LIG4-2R引物各lμ,SM4总DNAlμl为模板lμl,Pfu酶0.5μl,PCR程序：95°C×5min，(94°C×30s，55°C×30s,72°C×6min)---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---×30个循环，72°C×10min。第二轮：扩增pyrG基因：pyrG-F/pyrG-R引物各lμ,质粒pLAX-223为模板lμl,Pfu酶0.5μl,PCR程序：95°C×5min,(94°C×30s,58°C×30s,72°C×5min)×30个循环，72°C×10min,4°Cstore。两次PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，用高载量PCR纯化试剂盒冋收基因。第三轮：扩增融合基因(UG4-1)—pyrG—(UG4-2):分别用两次纯化后UG4-l,UG4-2,pyrG基因为模板各2μl，UG4-1F/LIG4-2R为引物各lμIP,Pfu酶0.5μLPCR程序：95°C预变性5min,(94°C×30s，54°C×30s,72°C×6min)×5个循环；(94°C×30s，52°C×30s,72°C×6min)×5个循环；(94°C×30s，60°C×30s,72°C×6min)×20个循环；72°C×10min。PCR产物纯...