菌物学报23（2）：183~187,2004Mycosystema秦岭地区子囊菌酵母物种多样性研究白逢彦*陆惠中王启明贾建华(中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室北京100080)摘要：从陕西秦岭地区的果实和叶等不同基物上分离得到子囊菌酵母262株，利用26SrDNA的D1/D2区域序列分析并结合形态学特征对这些菌株进行了分类学研究，探讨了该地区子囊菌酵母的物种多样性及其分布。共鉴定出10属31种，其中优势属为假丝酵母属Candida,12种，(其中新种2个，另文发表)、酿酒酵母属Saccharomyces,5种、毕赤酵母属Pichia,5种和有孢汉逊酵母属Hanseniaspora,3种。对分离自陕西秦岭不同地区与海拔的同一个种的不同菌株进行了D1/D2序列分析比较，以探讨子囊菌酵母种内序列稳定性和变异幅度。关键词：陕西，优势酵母属种，地理分布，26SrDNAD1/D2区，序列分析：Q939.96文献标识码：A：1672-6472（2004）02-0183-0187秦岭被视为中国亚热带和暖温带的分界山脉，山谷纵横，高温多变，气候温和湿润，生物资源丰富，有着从热带阔叶林向暖温带夏绿阔叶林过渡的植被景观。1991－1997年间中科院微生物所对秦岭地区的真菌进行了系统的考察研究，发现了该地区具有丰富的真菌资源（卯晓岚和庄剑云主编，1997）。然而，对该地区子囊菌酵母的系统研究还是空白。基于此，我们对位于陕西界内的秦岭部分区域，包括秦岭主峰太白山（3767米）的子囊菌酵母进行了考察。酵母菌的常规鉴定主要依赖于形态和生理特征，然而，这些特征均是表型性状，且会随着环境的变化有所改变，造成菌株鉴定的不可靠性（白逢彦，2002）。随着DNA序列分析技术的日趋成熟和简易化，rRNA基因（rDNA）及其转录间区（ITS）的序列分析已经被广泛应用于酵母菌的鉴定。Kurtzman和Robnett（1997，1998）和Fell等（2000）的研究表明大亚基rRNA基因（26SrDNA）中的D1/D2区域能将绝大部分子囊菌酵母和担子菌酵母的种区分开来，而种内不同菌株间D1/D2区域序列差异一般在1%以内，碱基差异在1%以上则可能代表不同的种。由于这些序列均已经公布于GenBank/EMBL/DDBJ等国际核酸序列数据库，为酵母菌的鉴定带来极大的便利。本研究利用D1/D2序列分析，并结合表型性状，探讨了中国陕西秦岭地区子囊菌酵母的物种多样性和分布。1材料与方法1.1样品采集和酵母菌分离于2002年10月上旬，赴陕西秦岭地区采集主要以果实和树叶为主的基物。取适量基物放于富集培养基（用浓HCl调至pH3.5-4.0的麦芽汁液体培养基）中25°C下进行富集培养，2~3天后过滤涂布麦芽汁琼脂平板，25°C下培养2~3天后挑取单菌落。纯化后用标准方法国家863项目(2001AA227131)和中科院知识创新工程重要方向项目(KSCX2-SW-101C)资助*通讯作者,e-mail:baify@sun.im.ac收原稿日期20031127收修改稿日期20040117---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---（Yarrow,1998）进行尿素酶测试，阴性反应者为子囊菌酵母。分离出的酵母菌放在-80°C超低温冰箱中保藏备用，已鉴定菌株交中科院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）保藏。1.2形态学观察根据酵母菌分类学研究标准方法（Yarrow,1998）对供试菌株进行形态学观察。1.3DNA提取、PCR扩增和测序DNA提取按照Makimura等（1994）的方法进行，详细步骤见白逢彦等（2002）。26SrDNAD1/D2区域序列的PCR扩增根据KurtzmanRobnett（1997）的方法，用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCAGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）扩增所测菌株的D1/D2区域，按下述反应条件进行36个循环：94°C,1min;55°C,1min;72°C,2min。所得PCR产物纯化后用引物NL1和NL4在ABI377型DNA自动测序仪上直接测序。进行同源序列搜索（BLASTsearch），以比较测试菌株与已知酵母菌种相应序列的相似程度，并结合形态学等表型分析，对其做出鉴定。菌株间的序列比较用ClustalX软件（Thompsonetal.,1997）进行。2结果与讨论2.1子囊菌酵母类群在位于陕西界内的秦岭多个地区采集得到不同基物样品71份，共分离得到子囊菌酵母262株（表1）。26SrDNAD1/D2区域序列分析和形态学观察结果表明，这些子囊菌酵母属于下列10个不同的属：假丝酵母属CandidaBerkhout,毕赤酵...