中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法研究摘要目的:建立一种中国人群运动性猝死相关基因多态性速测方法。方法:用Chelex法提取外周静脉血基因组DNA，应用定点突变技术获得运动性猝死相关基因的突变阳性DNA模板，然后通过等位基因特异性PCR法扩增目的基因。优化内参引物、多态引物的Tm值，引物浓度比例，PCR循环数等扩增条件；琼脂糖凝胶电泳进行基因分型。结果:AS-PCR可检测运动性猝死相关基因多态性，PCR产物琼脂糖凝胶分型与DNA测序结果完全一致。结论:本研究建立的AS-PCR方法适用于中国人群运动性猝死相关基因的快速检测。关键词运动性猝死；基因多态性；等位基因特异性PCRG804.83近年来，高强度竞技体育运动项目动性猝死案例频发，并且其数量呈逐年上升的态势。目前，临床对运动性猝死的常规检测手段主要有家族史、个人史筛查，体格及心电图检查若为阳性结果，则进一步查超声心动图、运动负荷试验和24小时动态心电图等[1]。但这些检测方法针对性不强，检出率低，具有较大的局限性。国内外对运动性猝死的研究表明[2]，死者的某些基因存在突变，大多表现为SNP或碱基缺失多态性。本研究选取KCNH2、KCNE1、SCN5A、KCNJ11、NUP155、CACNA1C、CACNB2b，7个与运动性猝死显著相关的热点突变基因的多态位点作为靶点，以AS-PCR方法为检测手段，从而建立准确、快速筛查运动性猝死基因多态性的方法。1.材料与方法1.1主要试剂及仪器Chelex-100购自上海生物工程公司；定点突变试剂盒MutanBESTKit，PMD18—TVector，PCR扩增试剂包括TaKaRaTaq™HotStartDNA热启动Taq酶，dNTPs,Buff以及核酸电泳分析试剂DL1000DNA分子量标准，DNA无毒染料，琼脂糖,均购自日本Takara公司；Bigdye3.1DAN测序试剂盒,购自美国Life公司。主要仪器设备有：美国ABI9700型PCR扩增仪，英国UVR电泳凝胶成像系统，美国ABI3130型DNA测序仪。1.2基因组DNA提取50例猝死个体临床血液样本,采用Chelex基因组DNA提取试剂盒,参照使用说明书操作,提取基因组DNA。取直径3-5mm血斑置于1.5ml离心管中，加入sdH2O1ml,振荡离心，弃上清，重复步骤两次，弃上清，将5%Chelex-100振荡悬浮后快速用剪掉头的枪头吸取200μl加入离心管中，振荡数秒，于56℃水浴保温30min后，振荡数秒，95℃沸水浴10min,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清为提取的DNA,-20℃保存备用。1.3阳性模板制备根据7个靶基因SNP位点设计突变引物，并进行PCR扩增，将引入突变位点的目的片段克隆到pMD18-TVector载体中，测序验证后作为后续PCR的DNA模板。1.4AS-PCR引物设计根据Genbank中的靶基因序列和AS-PCR原理，采用primerpremier5软件设计多态引物及内参引物，针对变异位点设计一对等位基因特异性引物,其3′末端分别与变异位点的碱基互补。为增加扩增特异性和检测分辨率,在3′端第2位引入错配碱基的AS-PCR引物。同时为排除PCR反应系统敏感性所致基因型判断失误,在AS引物上游设计了内参引物PF，下游共用引物PR与其中一种AS引物用作突变检测。内参引物与下游共用引物扩增较大的片段作为PCR的质控参照。AS-PCR引物设计原理示意图如图1.。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---图1.AS-PCR引物设计原理示意1.5AS-PCR反应及条件优化1.5.1AS-PCR反应本实验的反应条件为95℃3min，94℃30s，55～65℃30s，72℃30s；72℃3min，共35个循环。PCR缓冲液（其中，Tris-HClpH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶为5U/μl，内参上游引物的浓度为10uM,多态性引物的浓度为10uM，下游引物的浓度为10uM。1.5.2温度梯度PCR优化退火温度平行进行56管反应,设定温度梯度范围为55～65℃,各管的退火温度分别为:55.0、56.3、57.6、59.1、60.7、62.2、63.8、65.0。反应条件同上，反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,凝胶成像仪观察,选择无非特异条带,特异性条带最亮的管所对应退火温度为后续反应的退火温度。1.5.3引物浓度优化本实验采用半巢式PCR的方法进行扩增，因此存在PCR竞争的情况。将内参引物与目的基因引物的比例进行引物浓度优化。反应产物经用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,凝胶成像仪观察,选择内参条...