HPV与EBV检测的体会赵铁（安徽省铜陵市人民医院病理科安徽铜陵244000）【】R446【文献标识码】A【】1672-5085（2012）24-0153-01原位杂交是一种基因水平的定位检测，主要原理是根据碱基互补配对的原则，用特异性的探针与待侧标木的互补核酸序列杂交，经信号放大显色后镜下观察结果。只有较高的灵敏性和特异性。我科于2010年8月开展HPV、EBV原位杂交技术，现将在实际工作中的一些体会介绍如下。1材料与方法1.1材料：全部标木取自铜陵市人民医院病理科，慢性宫颈炎，并见挖空样细胞、宫颈高级别上皮内瘤变、宫颈癌等检测HPV;鼻咽癌，鼻咽粘膜上皮不典型增生、恶性淋巴瘤检测EBV,己知HPV、EBV阳性病例对照。试剂盒购自福州泰普生物科学有限公司。1.2方法1.2.1试剂配制：（1）l杂交增强液：100杂交增强液与蒸馏水1:99配制2）l蛋白酶K工作液:蛋白酶K与TBS1:25配制1.2.2组织处理：活检标木固定于4%中性甲醛液中，常规脱水包埋切片,切3-4um厚切片附干净的防脱载玻片中600C烘烤1小时以上，脱蜡水洗，蒸馏水中待用。1.2.3原位杂交：HPV型微波修复1）将切片放入盛有l杂交增强容器内，微波高火煮30分钟，自然冷却，蒸馏水洗2）滴加适量HPV高危型杂交液，加盖玻片，放置950C原位杂交仪变性5分钟，冷却放置30%湿盒增效液中370C孵育4—16小时。EBV型酶修复每张切片滴加适量l蛋白酶K工作液，室温孵育---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---5分钟，蒸馏水洗，过梯度洒精干燥后加杂交液，湿盒中放置550C恒温箱60—90分钟，再转至370C孵育4一16小时。以下HPV与EBV处理方法相同1）PBS脱水+浸泡l5分钟（48—550C）2）PBS浸泡35分钟（48—550C）3）加一抗30分钟（370C恒温箱内）4）PBS浸泡冲洗32分钟（370C）5）加二抗20分钟（室温）6）PBS浸泡冲洗32分钟（室温）7）加HRP聚合酶30分钟（室温）8）PBS浸泡冲洗32分钟（室温）9）DAB显色（室温）10）PBS浸泡冲洗（室温）11）水洗，苏木素复染，返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。2结果阳性信号定位细胞核，呈棕色。所检阳性结果与HE切片判断符合率95%。3体会研宄表明高危人乳头状瘤病毒感染与子宫颈癌及前驱疾病密切相关。因此，高危型HPV检测对子宫颈癌的筛査、诊断、治疗及愈后具有重要价值。同样，许多肿瘤和非肿瘤性疾病与EBV感染有关。在实际检测过程中应注意：（1）前期处理工作很重要，适当的固定液（建议用4%中性甲醛液），洁净的载玻片与合适的黏附剂，如果不当，易造成背景染色或脱片。试剂的保存要严格，以最大限度保证探针的稳定性；（2）组织固定过度或陈旧性标本易产生阳性较弱或假阴性3、HPV950C变性之后，可以放在冰上速冷，亦可以自然冷却，放置至不烫手；（3）杂交过程中，洗涤温度要掌握好，可以用恒温水浴箱以保证洗涤温度，不---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---同PH不同温度的漂洗液能够奋效降低背景染色，建议PBS缓冲液PH值调整为7.6,洗涤温度500C;（4）微波处理及酶处理是关键，是影响试验结果的重要因素。微波处理不能一次性处理时间过长，建议分3次，每次10分钟，及时补充杂交增强液，以防干片。酶K孵育吋间不可过长或过短，过短消化不够影响阳性表达，太长容易消化过度引起核酸流失，一般用吋5分半左右。（5）30%湿盒增效液，紧急情况下可以用蒸馏水代替。（6）对每批新购置的试剂盒必须做阳性和阴性对照，以保证试剂的可靠性。（7）切片要薄，一方面保证脱蜡的完全，一方面不易掉片。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---