激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。2．1观察活细胞、活组织ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等;而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。2．2生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平2．3动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变化。2．4数据、图像的数字化用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输出或长期储存,而且还可进一步加工处理。2．5定量测量首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。3华中地区有激光共聚焦显微镜机构的品牌和技术参数3．1中国科学院武汉病毒研究所，3．2湖南中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所LSCM(BIO-ROD1024,HOMELHEMPSTEAD,UK发表过应用激光扫描共聚焦显微镜观察骨组织为损伤的实验研究3．3华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科激光扫描共聚焦显微镜(ＭＲＣ1024型,美国ＢｉｏＲａｄ公司生产发表过激光扫描共聚焦显微镜检测核因子κＢ4激光扫描共聚焦显微镜的使用（cAMP在体测量为例）4．1样品制备4．1．1切片实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。常用的贴附剂有：多聚赖氨酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶cell-Tak,vectabond等。4．1．2培养细胞培养细胞可以满足要求，如果用购置仪器时所带的薄底培养瓶进行培养则更佳4．1．3激光共聚焦观察样品处理注意事项首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明...