药理学专业毕业论文[精品论文]白念珠菌耐药性产生的“线粒体氧化呼吸抑制”机制关键词：白念珠菌耐药性线粒体药物敏感性交替氧化摘要：白念珠菌易于感染、难以防治的主要原因在于其具有“高适应性”的特点主要表现为高致病性和高耐药性。近年来，白念珠菌适应氧化刺激的机制受到日益关注。本课题前期研究结果提示，白念珠菌线粒体氧化呼吸功能的改变在其适应性耐药性形成过程中可能也发挥着重要作用，即白念珠菌耐药子代的线粒体氧化呼吸功能减弱，代偿性加强细胞质内糖酵解、乙醛酸循环等代谢途径以供能，从而使氟康唑不能有效促进其内源性活性氧升高，使其对氟康唑的敏感性下降。因此，深入研究白念珠菌线粒体呼吸功能与其药物敏感性的关系对进一步阐明白念珠菌耐药机制具有重要意义。目的：从多方面、多层次地阐明我们所提出的“线粒体氧化呼吸抑制”假说：一方面，使用线粒体呼吸链抑制剂阻断或抑制白念珠菌线粒体氧化呼吸，考察菌株对唑类药物的敏感性是否降低。另一方面通过抑制糖酵解的酶活性，阻断糖酵解代谢通路，或者使用氧化磷酸化解偶联剂进而增强线粒体氧化呼吸，考察白念珠菌对唑类药物的敏感性是否升高。同时，通过靶向敲除和原位高表达线粒体醛脱氢酶ALD5基因，考察该基因对于白念珠菌线粒体呼吸、对唑类药物敏感性的影响，从而间接证明线粒体呼吸功能在白念珠菌耐药性形成中的作用。此外，考察白念珠菌ERG3、ERG11、TAC1基因耐药相关特异性突变位点；考察白念珠菌新基因ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518的耐药相关功能。方法：(一)通过点板实验和抑菌圈实验，分别考察氰化钾和水杨基氧肟酸作用下，白念珠菌对唑类药物敏感性的变化。通过抑菌圈实验，考察白念珠菌交替氧化酶AOX基因缺失菌分别在氰化钾和水杨基氧肟酸作用下，对唑类药物敏感性的变化。通过荧光染色，检测白念珠菌交替氧化酶AOX基因缺失菌在咪康唑或苯菌灵作用下的细胞内活性氧水平。通过棋盘式微量液基稀释法检测氟康唑与水杨基氧肟酸联合用药的抑菌效果。通过抑菌圈实验，分别考察氧化磷酸化解偶联剂、7％乙醇、6-磷酸海藻糖作用下，白念珠菌对唑类药物敏感性的变化。(二)采用Ura-blast策略，构建含有目的基因上、下游同源重组片段的IJRA3-HisG-URA3敲除盒，醋酸锂法转染白念珠菌，通过两次同源重组，使亲本菌的ALD5基因被敲除盒同源重组，从而构建ALD5基因缺失菌，并通过基因组DNA的套式PCR和Hsouthern杂交验证。构建ALD5基因高表达质粒，将ALD5基因完整开放阅读框置于pCaEXP高表达载体中MET3启动子的控制下；醋酸锂法转染白念珠菌ALD5基因缺失菌，PCR鉴定ALD5基因的原位整合，实时定量PCR筛选ALD5基因表达量明显升高的菌株。利用微量液基稀释法和点板法考察ALD5基因缺失菌在不同碳源培养基上对唑类药物的敏感性是否改变；通过流式细胞仪检测ALD5基因敲除菌的细胞周期；通过荧光显微镜检测ALD5基因敲除菌的细胞膜、细胞核形态；分别使用不同培养条件，考察ALD5基因敲除菌的菌丝形成能力和生物膜形成能力；与哺乳动物巨噬细胞共孵育，考察ALD5基因敲除菌对巨噬细胞的敏感性；通过荧光染料检测ALD5基因敲除菌的线粒体膜电位和内源性活性氧水平。(三)以白念珠菌敏感亲本y0109s和耐药子代y0109R基因组DNA为模板，PCR扩增ERG3、ERG11、TAC1基因全长开放阅读框，并与白念珠菌基因组数据库比对，分析基因突变位点。(四)分别构建含有目的基因ORF19.1510上、下游同源重组片段的HIS1、LEU2敲除盒，醋酸锂法转染白念珠菌，通过两次同源重组，使亲本菌的ORF19.1510基因被敲除盒同源重组，从而构建ORF19.1510基因插入失活缺失菌，并通过基因组DNA套式PCR验证。按照同样方法，分别构建ORF19.3216、ORF19.5518基因插入失活缺失菌。通过荧光显微镜分别检测ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因敲除菌的细胞膜、细胞核形态；分别使用不同培养条件，考察ORF19.1510基因敲除菌的菌丝形成能力；利用微量液基稀释法和点板法分别考察ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因缺失菌对唑类药物、盐刺激、渗透刺激、过氧化氢刺激、DNA抑制剂的敏感性是否改变；通过流式细胞仪分别检测ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5...