浅析LSF促进肝癌细胞侵袭转移及分子机制周焕城彭广福宋越张彩云温治强徐继威肖胜兵李嘉(广东省梅州市人民医院514000)【摘要】目的：探讨LSF促进肝癌细胞生长及具体的分子机制。方法：1、构建真核表达质粒pcDNA-3-HA-LSF，2、质粒转染肝癌细胞HepG2,通过Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭力的改变,3、通过RT-PCR、westernblot实验观察骨桥蛋白(OPN)的变化。结果：1、成功构建质粒pcDNA-3-HA-LSF，2、转染质粒pcDNA-3-HA-LSF后，HepG2细胞的侵袭力增强，3、转染质粒pcDNA-3-HA-LSF后，OPN的mRNA和蛋白水平显著提高。结论：LSF通过上调OPN,促进肝癌细胞的侵袭和转移。【关键词】肝癌LSF骨桥蛋白Matrigel侵袭肿瘤侵袭【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2013)03-0031-02原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，不仅它的发病率居于世界恶性肿瘤的第五位，位于中国恶性肿瘤的第二位。同时它的死亡率也位于世界恶性肿瘤的第四位［1］。但是目前对于HCC的发病机制尚不完全清楚，因此，给临床治疗带来了相当的网难［2］。晚SV-40转录因子LSF(LateSV40Factor),属于LSF家族，普遍存在于各物种体内，是细胞周期中G1/S过渡所必需的［3］。LSF蛋白的表达水平在癌细胞中异常升高，尤其在HCC细胞系中。LSF是一种转录因子，研究发现骨桥蛋白直接受到LSF的调控。骨桥蛋白OPN通过刺激细胞信号转导促进肿瘤恶性发展并能加强转移性细胞的生存［4］。木实验探讨LSF促进肝癌细胞侵袭转移的分子机制，为肝癌细胞的治疗提供新的靶点。1实验材料与方法1.1实验材料：真核表达质粒pcDNA3来自木实验室，LSF的cDNA购自SantaCruze，标签蛋白HA、蛋白OPN的抗体均购自Abeam，转炎试剂Lipo2000购自Invitrogen,人肝癌细胞SMMC-7721购自中科院细胞库。1.2细胞的培养与转染按照ATCC的方法培养细胞。人肝癌细胞SMMC-7721于含10%胎牛血清的DMEM中培养，培养条件为5%CO2,37"C恒温培养箱，2-3天传代•一次。按照Invitrogen的转染试剂Lipo2000的操作说明书，进行细胞的转染。本研究的实验处理为：对照组即不做任何处理的肝癌细胞SMMC-7721组，Mock组即转染空载质粒pcDNA3的细胞组，实验组即转染重组质粒pcDNA3-HA-LSF的细胞组1.3WesternBlot实验检测细胞内LSF的表达将对数生长期的肿瘤细胞以5×106/孔的密度分别接种于6孔板中，每孔2ml培液，置于37°C、5%CO2培养箱中进行培养。分别按照实验设计的处理分组，转染细胞24h后，用蛋白裂解液处理细胞，收集蛋白样品。将蛋白样品用BCA蛋白定量试剂盒定量后，每孔加入50μg的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转到PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭lh,加一抗Actin（l:1000稀释）、OPN（1：1000稀释），4°C孵育过夜，TBST洗膜10min×3次后，加荧光二抗（1:3000）稀释，室温lh，TBST洗膜10min×3,ECL发光检测LSF的表达。1.4TransWell侵袭实验将侵袭实验需用的8um孔径的TransWell特制小杯，置于24孔板中，将对数生长期的肿瘤细胞以l×105/孔的密度分别接种于24孔板中，然后加500ulDMEM+0.1%BSA的新鲜培养液。置于37°C、5%C02培养箱中进行培养。分别按照实验设计的处理分组，培养15h后，取出侵袭的小杯，PBS冲洗后，用棉花棒刮去杯底部膜杯内的细胞，而在膜杯外的细胞即为穿过膜的细胞，用95%乙醇固定lOmin，0.2%的结晶紫染色，PBS冲洗，风干后镜检，镜下选择6个视野计数并统计求平均值，拍照。1.5OPN基因的RT-PCR检测根据RT-PCR引物设计的数据库，上游：5-CCTTGACGCCGATTTAGCGTC-3,下游:5-CCGTACCGATTAGCGAACTAGCTAGC-3。根据实验设计的不同分组，分别对细胞进行不同的处理。转染24h后，提取细胞中的RNA，然后逆转录为相应的cDNA序列，根据设计的引物，检测OPN的mRNA表达水平。1.6WesternBlot实验检测细胞内OPN的表达将对数生长期的肿瘤细胞以5×106/孔的密度分别接种于6孔板中,每孔2ml培液，置于37°C、5%CO2培养箱中进行培养。分别按照实验设计的处理分组，转染细胞24h后，用蛋白裂解液处理细胞，收集蛋白样品。将蛋白样品用BCA蛋白定量试剂盒定量后，每孔加入50μg的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳...