止颤汤对神经干细胞移植后帕金森病大鼠尿液中DA及其代谢产物含量摘要：目的观察止颤汤对神经干细胞（NSC）移植后帕金森病（PD）大鼠尿液中多巴胺（DA）及其代谢产物含量的影响，探讨其对NSC移植后存活及定向分化的作用。方法1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）脑内定向注射建立PD大鼠模型，经NSC移植后予止颤汤灌胃。应用高效液相色谱法（HPLC）测定PD大鼠尿液中DA及其代谢产物高香草酸（HVA）、双羟苯乙酸（DOPAC）的含量。结果止颤汤可以提高NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物的含量并改善其行为学。结论止颤汤可能促进PD大鼠脑内NSC移植后的存活，并且分化为多巴胺能神经元发挥功能，同时抑制DA排泄，从而达到治疗作用。关键词：帕金森病；止颤汤；干细胞移植；DA代谢；大鼠：R742.5R285.5文献标识码：A：1672-1349（2011）08-0975-02帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是由于多种原因导致脑内黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经元退行性病变从而DA分泌减少引起的。干细胞移植是PD的理想治疗方法［1］，通过干细胞中最适合于中枢神经系统细胞替代治疗的神经干细胞（neuralstemcell，NSC）移植以期重建PD患者DA能神经元的功能。因此如何促使移植入脑内的NSC存活且定向分化为DA能神经元，并发挥功能成为亟得解决的问题。本实验观察了中药复方止颤汤对NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物含量的影响，以期为解决NSC移植治疗PD中的疑难问题提供中医药实验依据。1材料与方法1.1实验动物Wistar大鼠48只，均为雄性，体重260g±20g，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物编号：SCXK（沪）2007-0005。1.2药品与试剂止颤汤主要由黄芪、丹参、白芍、升麻、知母、钩藤等8味中药组成。诸药均经鉴定符合药典规定的质量标准。高效液相所用的标准品DA、DOPAC、HVA：美国Sigma公司。1.3主要仪器鼠脑立体定位仪：上海江湾Ⅱ型，液相色谱仪：HPLCAgilent1200，AgilentZorbaxoligo80mm×6.2mm,5μmcolumn。1.4方法1.4.1模型制备采用大鼠脑立体定位MPTP注射法制模［2］。术后14d，颈部皮下注射诱导剂阿扑吗啡（Apo）后，测量大鼠30min内向损毁侧旋转总次数，若大鼠旋转圈数>210r/30min（>7r/min），视为成功PD大鼠模型。1.4.2NSC的分离培养及鉴定参照文献［3］，选取孕14d的Wistar大鼠胚胎，分离出中脑组织，机械消化成单细胞悬液，种植于塑料培养瓶中，5%二氧化碳，37℃环境中培养，待原代克隆出现后（7d～10d），离心收集神经球，胰酶消化，吹打成单细胞悬液，1×105/mL浓度种植于新培液中，每7d换液传代1次，离心收集形成的神经球，经甩片到多聚赖氨酸包被的玻片上，固定后进行免疫细胞染色，检测NSC特异性蛋白Nestin的表达，鉴定所培养细胞中NSC细胞数量及传代后生长情况。1.4.3动物分组及给药将48只大鼠随机分为4组。NSC移植组：大鼠PD模型制作后，将NSC注射入PD大鼠损毁侧黑质纹状体内，同时用生理盐水4mL，每天分2次灌胃。正常组：正常大鼠，脑内同一位置注射等量培养基，同时用生理盐水4mL，每天分2次灌胃。模型组：模型制作后，同正常组处理。止颤汤组：同样方法将NSC移植入PD大鼠模型，同时将止颤汤1.2mL/100g用生理盐水稀释为4mL，每天分2次灌胃。1.4.4行为学测试分别于处理后7d、14d、28d颈部皮下注射阿扑吗啡，诱发其旋转行为，动物旋转时以患侧后肢为支点、身体环曲、首尾相接的原地旋转，伴觅食样动作，旋转360°为一转，30min内记录大鼠的旋转圈数。1.4.5取材及材料处理动物在处理后第28天末次灌胃后进行行为学测试，次日晨收集尿液置入-80℃超低温冰箱保存备用。测样时，室温下解冻，每次进样10μL。高效液相色谱法检测DA、DOPAC及HVA含量［4］。1.5统计学处理数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用t检验，采用统计软件中One-WayANOVA进行单因素方差分析。2结果2.1大鼠行为学测试结果（见表1）表1各组大鼠行为学测试结果比较（x±s）r/30min2.2PD大鼠尿液中DA、DOPAC、HVA含量及DA/DOPAC、DA/HVA比值比较（见表2）3讨论止颤汤是本科室李如奎教授多年治疗PD的经验效方，主要有黄芪、当归、丹参等药组成，有益气养阴、清热祛瘀、熄风通络作用，在临床研究中取得较好疗...