细菌人工染色体基因组文库构建方法的改进耿士忠潘志明张玉红(扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009)摘要：目的：建立一种更简便、易操作的BAC文库构建的改进方法；方法：在构建猪霍乱沙门氏菌基因组基因大片段DNA的BAC文库过程中，通过对改进的基因组BAC文库建立方法和常规的BAC文库构建方法相比较；结果：利用改进的方法简便快速地成功构建猪霍乱沙门氏菌基因组BAC文库；结论：结果表明在使用这两种方法构建的BAC文库中,所获得的转化效率,及在BAC克隆中插入的DNA片段的大小和BAC克隆的稳定性等方面都相同,从而证明本文所介绍的方法是一种更简单、更方便的方法,它能使BAC文库的构建更为高效。关键词：猪霍乱沙门氏菌，BAC，基因组文库：文献标识码：IMPROVENTOFCONSTRUCYIONOFBACTERIALARTIFICIALCHROMOSOME(BAC)LIBRARYGengShi-zhongPanZhi-mingHuang激n-linZhangYu-hong(BioscienceBiotechnologecollege,YangZhouUniversity,225009)Abstract:Objective：tosetupakindofimprovedmethodofconstructionBAClibrarywhichissimplerandeasier；Methods：IntheofconstructionBAClibraryofgenomeofS.choleraesuis,animprovedmethodofconstructingBAClibrarywasintroducedtoconstructS.choleraesuislibraryofgenome,whichwascomparedwiththekitofconstructingBAClibraryatthesametime；Results：byimprovedmethod,BAClibraryofS.choleraesuisofgenomewassuccessfullyconstructedsimplyandquickly；Conclusion：TheresultshowimprovedmethodandtraditionalmethodweresameintheinsertedDNAsegment,transformingefficiencyandthestabilityofBACcolony.SoitprovesthattheintroducedmethodissimplerandmoreadvantageoustoconstructBAClibrary.Keywords:S.choleraesuis，BAC，libraryofgenome引言：在各种基因组DNA大片段文库中，细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)文库以其遗传性能稳定,嵌合体少，易于操作等显著优势而被人们广泛利用,和常规的分子克隆过程是一样的，细菌人工染色体基因组文库构建过程主要包括载体的制备(提取、线性化、碱性磷酸化处理)、基因组DNA制备、载体和基因组DNA连接、转化、鉴定等程序。但是pBeloBAC11BAC载体是单拷贝的质粒,所以要培养大量的菌体,才能得到一定量的粗提质粒,要获得高纯度的质粒DNA还需经过氯化铯梯度超速离心。因此载体制备的成本高,时间长。基因组的制备由于片段较大，较难提取与纯化。常规的碱性磷酸化，连接、转化不能满足>95%白班菌落的要求。本文就细菌人工染色体基因组文库构建过程中所涉及到的过程加以改进，使BAC文库的构建更为容易、高效。结合猪霍乱沙门氏菌基因组文库的建立简要介绍该改进的方法。收稿日期：基金项目：扬州大学校基金(项目批准号OK0413174)作者简介：耿士忠(1972-),男,江苏高邮人，博士，扬州大学生物科学与技术学院动物研究室教师，主要从事分子生物学的研究Email：gszzsg119@yahoo一、材料与方法1.1材料与仪器BACBAC载体(pBeloBAC11，7.4Kb)，pUC19载体,HindIII限制性内切酶，DNA连接酶，碱性磷酸酶SAP，购自大连宝生物公司(Takara)；Bio-rad脉冲电泳仪，Electroporator2510电转化仪。1.2、方法1.2.1、BAC载体(pBeloBAC11，7.4Kb)的改造[1,2,3,4]pBeloBAC11vectorHindIII(BamHIorEcorI)酶切后插入pUC19相应的HindIII(BamHIorEcorI)位点，这样就形成了一种高拷贝的载体。因为改进的BAC载体是将单拷贝的pBeloBAC11BAC载体和高拷贝的pUC19连接成一个较大的新载体pUC-BAC。这个BAC载体由于并入了pUC19载体,在E.coliDH5α菌株中可以高拷贝复制。用单一限制性内切酶HindIII(BamHIorEcorI)酶切质粒pUC-BAC的多克隆位点,再经过凝胶电泳分离,DNA片段回收,可得到7.4Kb的线性载体。高拷贝质粒的应用较好地克服了因质粒的单拷贝而使BAC载体制备困难的问题。这种方法可使BAC载体的制备更为简易,而且BAC载体的纯度更高，使BAC文库的构建更为高效。1.2.2载体的碱性磷酸化处理用过量(25ui/μg)的HindIII酶切改造质粒6μg即DNA6μg，10Xbuffer5μl，HindIII酶150ui，水补足50μl酶切体系，37℃60min，65℃灭活HindI...