利用体内电脉冲增强治疗型HBVDNA疫苗细胞免疫反应探究［摘要］目的:研究在初次免疫和加强免疫阶段分别使用不同的免疫模式能否增强HBVDNA疫苗的细胞免疫反应。方法:肌内注射10pgHBVDNA疫苗的Balb/c小鼠根据电脉冲实施时间的不同选择两种免疫模式,DNA+EP或EP+3d+DNA,按在初次免疫和加强免疫阶段免疫模式的不同组合次序进行分组。各组小鼠在实施加强免疫后第14天取脾细胞做抗原特异的IFN-yELISPOT检测和FACS分析。结果:在初次免疫和加强免疫阶段使用不同免疫模式的实验组与采用相同免疫模式的实验组相比,诱导的特异性IFN-yT细胞频数和IFN-y的CD8+T细胞百分比均增加了4倍以上，差异有高度统计学意义(P0.05)o结论:在初次免疫和加强免疫阶段利用体内电脉冲实施不同的免疫模式能显著增强HBVDNA疫苗在动物体内的细胞免疫效果。［关键词］HBVDNA疫苗;体内电脉冲;初次免疫■加强免疫策略;细胞免疫反应［中图分类号］R392［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2010)04(b)-023-04AlternatingimmunemodesutilizingelectricpulsesinvivoenhancecellularimmuneresponsesinducedbytherapeuticHBVDNAvaccineQIULigong,SUNXihai,WEIJian,ZHAOLiang,HUANGMing(BaidiBio-PharmaceuticalR&DCenter,GuangzhouPharmaceuticalHoldingsLimited,Guangzhou511495,China)[Abstract]Objective:ToinvestigatethepossibilityofimprovingcellularimmuneresponsesinducedbyHBVDNAvaccinebyalternatingimmunemodesinprime-boostregimen.Methods:Balb/cmicetobevaccinatedwith10pgHBVDNAvaccineweredividedaccordingtotheorderofimmunemodeswhichcouldbechosenbetweentwoalternativeimmunemodes(DNA+EPorEP+3d+DNA)andcouldbesameoralternatinginprime-boostregimen.Thesplenocytesfrommiceofallgroupsweredetectedbyantigen-specificIFN-yELISPOTandFACSassaysatthe14thdayafterboost.Results:Thenumbersofantigen-specificIFN-ysecretingTcellorCD8+Tpercentagefromgroupsofalternatingimmunemodeswere4timeshigherthanthoseofthesameimmunemodes(P0.05).Conclusion:Alternatingimmunemodesinprime-boostregimenutilizingelectricpulsescaninducehighlevelsofcellularimmuneresponses・[Keywords]HBVDNAvaccine;Electricpulsesinvivo;Prime-booststrategy;Cellularimmuneresponses近年来，以质粒DNA为基础的免疫方法广泛应用于疾病预防和治疗研究中，显示了巨大的治疗潜力。为了提高质粒DNA的免疫原性和免疫效果，学者们进行了各种方法和策略的研究，其中以电脉冲(electricpulse,EP)介导的DNA疫苗免疫方法在激发高水平免疫反应方面具有突出的效果。EP能增强DNA疫苗的免疫应答，其效应不受实验动物种属的限制［1-2］o现有的研究和临床方案中普遍采用肌注质粒DNA后立即使用体内电脉冲的模式(DNA+EP模式)，主要是利用电脉冲促进外源DNA的转染效果,从而达到增强免疫反应的效果。最近,Peng等［3］在研究中率先采用了一种全新的免疫模式:在肌肉部位预先实施体内电脉冲，几天后于原位免疫注射DNA疫苗，即EP+nd+DNA模式。研究结果表明，注射前进行电脉冲的模式下质粒的转染率和表达量较低,但这种模式和DNA+EP模式一样能产生相近滴度的IgG抗体。实验数据表明，在EP+nd+DNA模式中抗原递呈细胞直接转染、表达外源基因成为加强肌注DNA疫苗免疫反应的主要因素。Peng等［3］证明EP+nd+DNA免疫模式主要是通过直接递呈(directpresentation)的机制诱导免疫反应，但对DNA+EP模式的主要抗原递呈机制还不清楚。另外,这两种利用电脉冲的免疫模式之间是否存在协同作用尚需进一步研究。本实验以Balb/c小鼠为实验动物模型，研究在不同的电脉冲模式下使用初次免疫结合加强免疫(prime-boost)策略增强治疗型乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的免疫效果，发现在prime和boost阶段分别使用不同的电脉冲联合疫苗注射免疫模式能激发更强的细胞免疫效果。现将研究结果报道如下：1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物Balb/c小鼠，雌性,6~8周龄,SPF级,购自广东省医学实验动物中心。1.1.2试剂及仪器1.1.2.1主要试剂真核表达质粒pcDNAS2S,编码HBV表面抗原preS2S,广州...