基于自然对流PCR与毛细管电泳技术的牙周病原菌检测王林燕陶春先山口佳则李振庆：1005-5630（2018）06-0007-06摘要：细菌种类的快速识别在牙病防治中具有重要的应用价值。以牙周病原菌为研究对象，建立了DNA快速扩增的自然对流聚合酶链式反应（PCR）方法及毛细管电泳荧光光学检测系统。研究表明，当毛细管有效长度为8cm、电场强度为100V/cm时，50bpDNAladder在筛分介质为0.5%HEC（羟乙基纤维素）（1300K）中的分离效果最佳。毛细管电泳结果表明，采用自然对流法可以在25min内在圆柱腔体中实现牙周病原菌的快速PCR。关键词：毛细管电泳系统;聚合酶链式反应（PCR）;自然对流：O657.7文献标志码：Adoi：10.3969/j.issn.1005-5630.2018.06.002引言牙周病仅次于龋病，是危害人类牙齿健康的第二大口腔疾病，通常是由龈下菌斑引起的[1-3]。人口腔内的细菌附着在牙齿表面形成牙菌斑，当这些细菌及其产物进入牙龈，便会引起牙龈纤维溶解及炎症，炎症导致牙槽骨吸收，随之牙齿出现松动甚至脱落[4]。据世界卫生组织统计，90%～95%的老年人都患有不同程度的牙周病，这也是人牙齿过早脱落的主要原因。同时，研究表明，牙周病还与中风、冠心病、糖尿病等疾病有一定的关系。随着我国进入老龄化社会，这一健康问题将日益突出，为此，及时发现早期牙周病症，并对其加以控制和治疗，对牙齿健康具有重要的意义。研究表明，在一些破坏性牙周病及其传播中，特异性病原菌的作用成为大家研究的焦点。在这些牙周病致病菌中，革兰氏阴性杆菌如齿垢密螺旋体（treponemadenticola，T.d）等被认为是与牙周病发病机理密切相关的细菌[5]。它们在牙周病患者的口腔中大量生存，而在健康者口腔中没有发现或存在数量极少。为此，微生物检测有助于实现牙周病的早期诊断。虽然目前有细菌培养、形态学观察、荧光抗体法[6]等方法对细菌进行鉴定和检测，但这些方法因费时、费力、缺乏准确性，使牙周病致病菌的检验在临床应用上受到很大限制，难以推广。因此，建立快速的菌种检测方法对研究牙周病致病菌及牙周病预防和治疗有非常重要的意义。尽管现行的聚合酶链式反应[7-9]（polymerasechainreaction，PCR）方法效率相对较高，但是传统的PCR热循环仪受变温效率的限制，DNA样品扩增时间相对较长。为此，本文基于自然对流理论，在试建的便携式自然对流PCR（naturalconvectionPCR，NCPCR）系统中对齿垢密螺旋体实现了快速PCR，并采用毛细管电泳法[10-11]对其PCR产物实现了快速检测。1原理及方法自然对流PCR[12-13]是在一个圆柱型腔体内进行的，腔体的上表面保持低温（55℃），下表面保持高温（97℃）。由于上下表面温度差使得腔体内不同位置流体的密度分布不同，温度高的流体密度小，温度低的流体密度大，从而使得底部液体上升，腔内顶部液体下降，最终使得液体在腔体内形成对流循环。当腔体内注入含有DNA模板及引物的PCR反应液时，通过优化圆柱腔体的几何尺寸，腔体反应液便可以携带DNA经PCR的不同温区，最终实现DNA的自然对流PCR。依据电泳的基本原理，实验室自制了毛细管电泳荧光光学检测系统，如图1所示，其核心部件为石英毛细管（PolymicroTechnologies，美国）、正置显微镜BX51（奥林巴斯，日本）、MODEL610E高压电源（Trek公司，美国）。其工作原理如下：汞灯光源发出的光经UMWIB3滤光片（奥林巴斯，日本）过滤后产生波长为494nm的激发光;DNA与荧光染料SYBRGreenI结合物在高压电场下流经毛细管，当DNA经过毛细管窗口时，受入射光激发（494nm），产生中心波长为521nm的荧光;荧光经光电倍增管R928（滨松光子学株式会社，日本）收集，获得DNA的电泳图谱，经CCD收集，可获取DNA在毛细管内的运动图像。为降低电渗流，采用线性聚丙烯酰胺对毛细管内壁进行镀膜处理，电泳过程是在25℃的恒温暗室中完成。2试剂配制2.1PCR反应试剂配制在研制的便携式自然对流PCR系统中对齿垢密螺旋体T.d实施PCR反应。T.d引物为5′AAGGCGGTAGAGCCGCTCA3′和5′AGCCCGCGCTCA3′（生工生物工程（上海）股份有限公司），对应的PCR产物片段为283bp（bp表示碱基对）。将3.5μL10×FastBufferI、2.7μLdNTPMixture、0.7μLT.dDNA模板、0.7μL引物、0.175μ...