扁穗冰草PLD基因cDNA序列克隆及生物信息学分析摘要:利用RT-PCR技术和RACE方法克隆得到扁穗冰草(Agropyroncristatum(L.)Gaertn)PLD基因cDNA的全长,并对该cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、二级结构、三级结构、无序化特性进行了预测和分析.结果显示:扁穗冰草PLD基因具有2967个核苷酸,含有PLD所特有的HKD基序和C2结构域,属亲水性蛋白,二级结构以无规卷曲为主,蛋白质的三级结构显示两个HKD基序靠近形成具功能的活性位点,蛋白质无序化分析发现无序化区域较少;进化树分析表明与蒙古冰草亲缘关系最近,与草莓亲缘关系最远.为研究扁穗冰草PLD在干旱胁迫信号转导及应答过程的机理奠定基础.关键词:扁穗冰草;磷脂酶D;克隆;生物信息学;RACE:Q?@74文献标志码:A:1008-9497(2010)06-691-09脂酶D(PhospholipaseD,简称PLD)即磷脂酰胆碱磷脂水解酶(EC3.1.4.4),属催化磷酸二酯键水解和碱基交换的一类酶的总称.早在1947年文献[1]就从胡萝卜和白菜叶的提取物中发现了具有活性的PLD,但由于其多型性和不稳定性致使在此后很长一段时间没有得到充分的利用.直到1994年Kansas州立大学的王学敏教授利用萌发中的蓖麻种子的子叶作为试验材料,经过提取、分离与纯化,获得有活性的PLD,利用反转录技术获得cDNA[2].现已从白菜、胡萝卜[1]、黄瓜[3]、草莓[4]、花生[5]、葡萄[6]等多种植物中发现并提取PLD.PLD基因属于多基因家族,具有多分子异质性,在植物中PLD基因至少有5种类型12个成员,即PLDα1,PLDα2,PLDα3,PLDβ1,PLDβ2,PLDγ1,PLDγ2,PLDγ3,PLDδ,PLDε,PLDζ1,和PLDζ2[7],随着对PLD研究的进一步深入,现已证明具有多分子的异质性PLD的cDNA序列具有高度保守性[8].PLD参与许多生物的信号转导,包括藻类、绿色植物和动物[9].PLD通过水解磷脂酰胆碱产生磷脂酸,在植物的细胞信号转导、新陈代谢中扮演不同角色.PLD已显示参与细胞凋亡、细胞生长、囊泡运输、细胞支架的改变、根生长、生物胁迫应答和细胞氧化破裂等众多生命现象[10-16].扁穗冰草(Agropyroncristatum(L.)Gaertn)抗寒、耐旱,在我国东北、西北及内蒙古自治区等地有野生种分布,作为优良牧草已被栽培利用,是目前我国栽培的最耐干旱的牧草之一.本文以扁穗冰草中的PLD基因为研究对象,以NCBI数据库为基础,利用小麦等植物PLD基因的保守序列设计相应引物,通过RT-PCR技术和RACE法获得PLD基因的cDNA全序列.并利用生物信息学方法对其推导的氨基酸序列从组成、理化性质、疏水性及结构功能等方面进行了预测与分析,为扁穗冰草PLD的进一步研究,特别是为研究在干旱胁迫信号转导及应答过程中PLD的作用奠定基础,同时在生产实践上为筛选抗旱的优良牧草资源,进行遗传改良提供理论依据.1材料与方法1.1实验材料扁穗冰草(A.cristatum)种子由中国农科院草原研究所种子资源库提供.供试扁穗冰草发芽后,均匀摆在含有蛭石的塑料杯中,25℃自然光培养15d后,提取叶片总RNA.RNAisoReagent、RNALAPCRTMKit、3′-FullRACEKit、5′-FullRACEKit、pMD19-T载体均为TaKaRa公司产品;DNAMarker为DL2000、凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;ExTaqDNAPolymerase购自Sangon公司;琼脂糖、IPTG、X-Gal均购自Promega公司.1.2RT-PCR法克隆扁穗冰草PLD基因的中间片断将不同种属植物的PLD基因序列进行同源性比较得出PLD基因cDNA序列的保守区,在此保守区设计两对引物.RT-PCR法获得扁穗冰草PLD基因中间片段.随后用1.2%琼脂糖凝胶回收PCR扩增的目的片段,pMD19-Tvector将目的片段与T-vector连接,鉴定重组质粒DNA,目的DNA片段送大连宝生物公司进行测序.1.3RACE法克隆扁穗冰草PLD基因末端序列3′RACE法扩增扁穗冰草PLD基因3′末端序列:cDNA第一条链的合成后,利用特异性上游引物Rf1,下游引物M13Primer进行PCR扩增反应.5′RACE法扩增扁穗冰草PLD基因5′末端序列:先去磷酸化处理、“去帽子”反应,然后通过5′RACEAdaptor的连接并反转录.1.4生物信息学分析在NCBI上通过Blastn和BlastP进行核苷酸序列、蛋白质序列同源性分析;联网至wwebi.ac.uk/clustalw/,将蛋白质同源性较高的氨基酸序列利用Seqverter转化为FASTA格式,进行多重比对分析.用VectorNTI9.0统计PLD中各...