稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立彭亮1,吴刚2,蒋继志1,靳风烁2,丁瑞2(1河北大学生命科学学院,保定071002;2第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科,重庆400042)提要:目的建立稳定高效表达正反义Alu-Sx的细胞系。方法根据Alu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA中构建成重组体。经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆。结果成功构建Alu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆。结论高效稳定表达正反义AluSx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究。关键词:Alu亚家族Sx;真核表达载体;HEK293细胞系;稳定转染中图法分类号:Q782;Q785;Q813文献标识码:AEstablishmentofHEK293celllineexpressingsenseandantisenseAlu-SxstablyandefficientlyPENGLiang1,WUGang2,激ANG激-zhi1,激NFeng-shuo2,DINGRui2(1CollegeofLifeScience,HebeiUniversity,Baoding071002,2DepartmentofUrinarySurgery,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)Abstract:ObjectiveToestablishaHEK293celllinestablyandhighlyexpressingsenseandantisenseAlu-Sx.MethodsAccordingtoAlusubfamilySxsequence,apairofprimerscontainingthesitesforgivenrestrictiveendonucleaseatbothendsweredesignedandsynthesized.PCRofthetotalDNAextractedfromHEK293celllinewasperformed,theproductsofwhichwereclonedintoahighlyefficienteukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1/myc-HisA.Therecombinantsweresequencedandidentifiedbyrestrictiveendonucleasedi-gestionandthentransfectedintotheHEK293celllinebylipofectamine2000.ThestabletransfectantswerescreenedbyG418.Cellsubcloneswereisolatedbygradientdilution.Thehighlyexpressingcloneswereidenti-fiedbyNorthernblotting.ResultsEukaryoticexpressingvectorsstablyandefficientlyexpressingsenseandantisenseAlu-SxwereconstructedandcellsubclonesstablyandefficientlyexpressingsenseandantisenseAluSxwereestablished.ConclusionCellsubclonesstablyandefficientlyexpressingsenseandantisenseAlu-Sxcanusedforourfurtherstudy.Keywords:AlusubfamilySx;eukaryoticexpressingvector;HEK293cellline;stabletransfectionAlu家族是灵长类基因组特有的含量丰富的中度重复序列,是短散在重复序列中最大的家族,也是基因组中最活跃的遗传元件之一[1]。Alu家族序列可产生不具有编码蛋白质的转录本,但是这些转录本有何功能还不是很清楚[2]。本研究通过构建正反义Alu家族Sx的真核表达载体,脂质体转染法转染HEK293细胞后通过筛选获得高效稳定表达的亚克隆,为进一步研究Alu序列可能在RNA剪切及表达调空的研究打下了基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种、细胞系和质粒DH5α大肠杆菌菌株为本室保存;人胚肾成纤维细胞系HEK293、高效真核表达载体pcDNA3.1/myc-HisA及带有绿色荧光蛋白(GFP)的对照质粒由第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室徐翔博士惠赠。1.1.2试剂细胞培养用DMEM以及小牛血清(Hyclone公司),细胞总DNA提取试剂盒(Promega公司),细胞转染用阳离子脂质体ipofectamine2000(Invitrogen公司),Wizardpurefec-tionplasmidDNApurificationsystem(Promega公司),DNA胶回收试剂盒以及---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---T4DNA连接酶(TaKaRa公司),限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ(TaKaRa公司),T4多核苷酸激酶试剂盒(Promega公司),PCR所用试剂(TaKaRa公司),Trizol试剂(Invitrogen公司),焦碳酸二乙酯(Sigma公司),RNaseZap(Ambion公司),腺苷[γ-32P]三磷酸盐(北京福瑞生物工程公司核酸研究室)。1.1.3PCR引物的设计合成根据GenBank数据库Alu亚家族Sx的序列设计两对引物,在上下游引物的5′引入相应的BamHⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶识别序列及保护碱基,经软件...