丹参酮HA磺酸钠和丹参素对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的激活机制张洁0,曾晓荣】，杨艳I,刘智飞I(1.泸州医学院心肌电生理研究室，卩q川泸州646000；2.成都医学院生理学教研室，四川成都610083)摘要：目的研究丹参酮IIA磺酸钠(DS-201)和丹参素(DS-182)的冠状动脉舒张作用除了已知的机制外，是否还与钙激活钾通道(Kca)有关。方法猪冠脉平滑肌细胞贴附式和内面向外式膜片钳单通道电流记录技术。结果DS-201和DS-182均可激活冠脉平滑肌细胞K(：a,但DS-201在内面向外膜片方式下激活K(b；而DS-182在细胞贴附膜片方式下激活心,。结论DS-201和DS-182激活K&的作用机制不同。DS-201能直接激活Kca,而DS-182则可能需要一系列胞内过程。这种差异可能与二者的结构和溶解性质不同有关。关键词：丹参酮UA磺酸钠；丹参素；钾通道；肌,平滑，血管；冠状血管；膜片钳技术中图分类号：R972文献标识码：A文章编号：1000・3002(2005)04・0270・04钙激活钾通道(calcium-activatedpotassiumchannels,心)是血管平滑肌上最主要的外向电流通道⑴。许多钾通道开放剂均作用于人⑺而舒张血管。其调节K(：a的机制包括:①直接激活心,如脂溶性的毗那地尔(pinacidil)直接作用于通道内口激活Kca［，1o②通过胞内过程间接激活K&,参与这一介导过程的第二信使有cGMP,cAMP,C丹等，如心钠素通过第二信使cGMP，降钙素基因相关肽通过收稿日期：2004-10-17接受日期：2005-05-09基金项目：国家自然科学基金资助项1=1(39370270)作者简介：张洁(1970-),女,四川省乐山人，讲师，医学硕士，主要从事心肌电生理研究；曾晓荣(1955-),男，教授，硕士生导师，研究方向为心肌电生理学。'*联系作者卜:-mail：zhangjiefa8888@126.comTel:(028)86579120cAMP,乙酰胆碱通过Ca2+间接激活心:汕有的药物还通过G蛋白直接激活Kg,如异丙肾上腺素⑵。丹参是一味重要的活血化瘀药，实验证明，其两个主要有效成分丹参酮FlA磺酸钠(sodiumtanshi-noneJJAsulfonate,DS-201)和丹参素(danshensu,DS-182)均可增加冠脉流量，其机制可能与阻滞钙内流有关⑶。据报道，DS・182能激活心肌细胞内向整流钾通道而具有保护心肌的作用⑷，提示丹参对心血管活动的影响可能不仅限于阻滞钙通道这一途径。因为Kg是冠脉平滑肌上最主要的外向电流通道,与冠脉的舒张密切相关,故本研究应用膜片钳技术,研究DS-201和DS-182的冠脉舒张作用是否与KCa活动相关,并比较其效应和作用机制。1材料和方法1.1仪器，药品和试剂FI本CEZ-2200型膜片钳放大器；VC-U型记忆示波器；SEN-7203型电子刺激器；PP-83型微电极拉制仪；IMT-2型倒置相差显微镜。DS-201,纯度$99.0%,复旦大学附属中山医院制剂科提供；DS・182,纯度$98.5%,复旦大学上海医学院天然药物化学教研室提供；四乙基鞍(tetraethylammoniumchloride,TEA),ATP,DIDS,EGTA,IIEPES为Sigma公司产品；其他试剂均为分析纯。1.2方法取原代培养⑸4〜10d的猪冠脉平滑肌细胞，用细胞贴附式和内而向外式两种膜片方式记录单通道电流。单通道电流信号通过膜片钳放大器放大，滤波(3kHz)后，输入计算机，用pCLAMP6.0.2软件系统(AXONINSTRUMENT)进行数据采样并分析通道活动的开放概率,平均开放时间，平均关闭时间和电流幅值。所有实验均在室温(20~24七)下进行。均采用对称性高钾液(140电极液成分为(nunol•L"1)：天冬氨酸钾(aspartate-K,K-asp)40,KC1100,IIEPES10,CaCl21,DIDS0.1,ATP2,pH7.4;细胞浴液成分为(mmol•L~1)：K-asp100,KC140,HEPES10,EGTA1,CaCl20.55,pH7.4,浴液中游离Ca?+浓度为0.1/xmol-L-'o形成细胞贴附式或内面向外式记录结构后，在细胞浴液中加入CaCl2,并改变钳制电压,确认为反九后，先记录正常的通道电流，然后在浴液中以10min间隔加入DS-201或DS-182,加药3min后,记录同一膜片同一通道，在不同药物浓度下的电流。最后观察5〜20mmol-f1TEA的阻断效应，进一步确定所记录通道为Kca01.3统计学处理结果以x±s表示，采用配对t检验。2结果2.1细胞贴附式膜片下DS-201对Kg的作用在不同钳制电压下，向浴液中加入5〜30/zmol-L-1DS-201对通道活动均无明显影响。通道开放概率和电流幅值在用药前后均无明显变化(n=5,P>0.05)o2.2内面向外式膜片下DS-...