3-蒈烯对铜绿假单胞菌的抑菌活性及机理初探刘雪何英兰胡月英陈卫军陈海明摘要为了开发一种新的食品防腐保鲜剂，本文初步研究了3-蒈烯对铜绿假单胞菌的抑菌活性及机理。通过肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），评价了3-蒈烯的抑菌活性，考察了3-蒈烯对细菌生长曲线、细胞形态、细胞膜通透性、膜电位及呼吸链脱氢酶等的影响。结果表明：3-蒈烯对铜绿假单胞菌的MIC为20mL/L，MBC为40mL/L。3-蒈烯可以抑制铜绿假单胞菌的生长，破坏细胞的正常形态，提高细胞膜的通透性，造成蛋白质、电解质的外泄。3-蒈烯能够降低铜绿假单胞菌菌体的膜电位，干扰细胞正常代谢活动，还能抑制细胞内呼吸链脱氢酶的活性。综上所述，3-蒈烯通过破坏铜绿假单胞菌细胞膜，抑制细菌正常生长，导致细菌细胞死亡。关键词3-蒈烯;铜绿假单胞菌;抑菌活性;抑菌机理;细胞膜TS205.9A近年来，随着社会的发展和生活水平的提高，食品安全开始受到人们广泛的关注。食源性疾病是中国食品安全的头号问题，也是世界重要的公共卫生问题，致病微生物的污染是造成食源性疾病的主要原因[1-2]。铜绿假单胞菌，又名绿脓杆菌，食源性致病菌之一，革兰氏阴性属，主要存在于肉制品和饮用水中，能产生外毒素、肠毒素等，容易造成食品腐败污染，危害人们身体健康，很多城市已经对其开展监测[3]。目前，为了减少食源性疾病的发生，延长食品货架期，防腐剂被广泛使用。精油作为一种植物源天然防腐剂，可以从多种芳香植物中提取，主要由萜类、倍半萜类化合物等组成[4]。已有大量报道证明，精油具有良好的抑菌活性，但是具体是哪种成分主要发挥作用，还鲜有研究[5-6]。3-蒈烯是许多植物精油的主要挥发性成分，包括松节油、胡椒油、当归油等。分子式为C10H16，是一种单萜烯，呈无色液体状态[7]。由于3-蒈烯本身的松木样香气，在食用香精中有广泛应用，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB2760-2014）中规定3-蒈烯为允许使用的食品用合成香料[8]。此外，3-蒈烯可用于农药、药物和化妆品，还是增塑剂等化学品中重要的原料之一[7]。吴桂苹等[9]通过气相色谱-质谱法（GC-MS）测得白胡椒精油中3-蒈烯的含量在21.94%～24.64%之间。Lomarat等[10]研究表明δ-3-蒈烯是黑胡椒油的主要成分（30.75%）。Zhang等[11]研究发现黑胡椒精油对肉中的致病菌——大肠杆菌具有明显的抑制效果。目前，有关3-蒈烯对铜绿假单胞菌的抑菌机理的探讨鲜有报道。本研究主要通过测定3-蒈烯的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）确定抑菌活性，通过铜绿假单胞菌扫描电镜观察和生长曲线、电导率、蛋白泄漏等指标的测定，初步分析3-蒈烯的抑菌机理，为3-蒈烯应用于食品的防腐保鲜提供理论依据。1材料与方法1.1材料铜绿假单胞菌（ATCC9027），广东省微生物菌种保藏中心。（+）-3-蒈烯（>90.0%），日本东京化成工业株式会社（TCI）;无菌磷酸盐缓冲液（PBS，浓度为0.1、0.01mol/L，pH7.4）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、牛肉膏、蛋白胨，北京索莱宝科技有限公司;罗丹明123，上海源叶生物科技有限公司;碱性磷酸酶（AKP）测试盒，南京建成生物工程研究所。无菌超净工作台，苏州佳寶净化工程设备有限公司;高压灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司;SPX型生化培养箱，宁波江南仪器厂;SHA-2型恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司;TGL-16M型高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司;5804R型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司;S-3000型扫描式电子显微镜，日本日立（Hitachi）工机有限公司;DDS-307型电导率仪，上海仪电科学仪器股份有限公司;TU1810型分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;F-280型荧光分光光度计，天津港东科技发展股份有限公司。1.2方法1.2.1菌种活化将铜绿假单胞菌在营养琼脂培养基中置于37℃培养箱培养18～24h进行传代恢复活性，培养后的细菌用无菌生理盐水（0.9%NaCl）将其从斜面上洗脱下来，采用麦氏比浊法把菌悬液的浓度进行稀释。1.2.2最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌剂浓度（MBC）的测定参照Huang等[12]的方法做适当调整，将3-蒈烯溶于70%乙醇中，稀释成800、400、200、100、50、25mL/L的抑制液，在平板中先加...