plRES2-EGFP-hlL-10真核表达载体构建及鉴定［摘要］目的构建带有报告基因EGFP的hIL/O真核表达载体。方法通过RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出IL-10基因，构建IL-10基因和报告基因EGFP基因真核表达载体plRES2-EGFP-hlL-10,经PCR、酶切、测序等方法进行鉴定，紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度。结果酶切、PCR及测序证实plRES2-EGFP-hlL-10载体序列正确。结论成功构建真核表达载体plRES2-EGFP-hlL-10,可为后续器官移植免疫耐受的研究奠定基础。［关键词］基因;IL/O基因;真核表达载体;载体构建［］Q754［文献标识码］A［］1673-9701(2009)34-01-03ConstructionandIdentificationofplRES2-EGFP-hlL-10PlasmidCHENLihongILIU激ngfeng2FANGHangrongIQIUMinglian21.DepartmentofPathology,Fu激anMedicalUniversity,Fuzhou350004,China;2.TheFirstAffiliated---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---HospitalofFu激anMedicalUniversity,Fuzhou350004,China[Abstract]ObjectiveToconstructtheplRES2-EGFP-hlL-10plasmidofhuman.MethodsIL-10genewasamplifiedfromhumanperipheralbloodlymphocytesbyusingRT-PCR,andthenplRES2-EGFP-hlL-10plasmidwasconstructed・Theidentificationwasdonebyusingendonucleasecutting,PCRandsequencingandtheplasmidconcentrationandpurityweredetectedbyusingUVspectrophotometer.ResultsEndonucleasecutting.PCRandsequencingshowedthesuccessfulconstructionofplRES2-EGFP-hlL-10plasmid.ConclusionWeconstructplRES2-EGFP-hlL-10plasmidsuccessfullyandlaythefoundationforimmunotoleranceresearches!ntheorgantransplantation.[Keywords]Gene;ILgene;Eukaryoticexpressionvector;Vectorconstruction白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是最初由Mosman等1989年发现的一种由Th2分泌的细胞因子，它能抑制Thl细胞因子的分泌。近来,越来越多的研究表明IL-10具有抑制免疫活性细胞的激活和细胞因子产生的作用,与移植物排斥有密切关系，因此在器官移植领域，越来越多的研究表明JL-10能通过---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---CGTATCTTCATTGTCoOligo(dT)引物1pL,AMV返转录多种途径来抑制或减轻排斥反应，从而延长移植物的存活时间。我们通过构建hlL-10真核表达载体为今后在器官移植免疫耐受的进一步实验研究提供依据。1材料与方法1.1外周血单核细胞的制备取正常人新鲜抗凝血5mL与Hanks液等量混匀后，加于4mL淋巴细胞分离液上,离心收集细胞，用5mL含10%的胎牛血清1640CM培养液悬浮，加入25mg/L的ConA,于37°C.5%CO2培养箱中孵育24h。1.2RT-PCR扩增人IL-10M因淋巴细胞经ConA刺激后，用Trizol试剂按说明书提取总RNAo逆转录体系为：模板RNA溶液5|jL,5xRTbuffer4pL,dNTP(各10mmol/L)混合物2pL,RNA酶抑制剂0・5pL,引物设计参照GenBank上人IL-10基因序列分别设计引物下、下游引物。上游引物:IL-10F:CCGCTCGAGCCACCATGCACAGCTCAGCACTGCTCT,下游弓I物:IL-10R:CCGGAATTCTCAGTTTDEPC水6.5pLo42°C保温仆,置95°C温育5min使AMV逆转录酶失活。将此反转录产物直接进行PCRo目的片段大小约540bpoPCR反应条件:949预变性2min,94°C变性30s,65°C退火30s,72°C延伸1min,共30个循环，最后---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养，采HiSpeedPlasmid(10mM)1mL,下游引729延伸10minoPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100V,30min),)^胶成像系统摄像。1.3真核表达载体plRES2七GFP41IL10的构建1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR产物，连同plRES2-EGFP空载体，经XhoI和EcoRI双酶切后,T4DNA连接MidiKit质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)抽提质粒，详见说明书。1.4真核表达载体plRES2-EGFP-hlL10鉴定1.4.1限制性内切酶酶切、电泳及片段回收取IL-10质粒抽提产物用(CTCGAGCCACCATG)和(GAATTCTCA)双酶切，反应体系:XhoI1pL,EcoRI1pL,10xKBuffer2pL,重组质粒(118pg/mL)5|jL,灭菌双蒸水11|jL,反应混合液混匀后置379酶切过夜后,1%琼脂糖电泳(100V,30min)...