一株无毒力鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定摘要：从湖北某地淘汰鸭的脑组织分离到一株短杆菌，命名为JLLY,经分离培养、形态学检查、生理生化试验、PCR鉴定及测序结果的分析，分离菌株被鉴定为鸭疫里默氏杆菌(Riemetellaanatipestifer)□在毒力测定试验中，将不同浓度的菌液腿部肌肉注射5口龄健康雏鸭。结果显示，分离株JLLY注射的试验动物无一死亡，可确定为无毒力。关键词：鸭疫里默氏杆菌(Riemetellaanatipestifer)；分离鉴定；毒力试验中图分类号：S852.61文献标识码:A文章编号:0439-8114(2013)22-5539-02鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)病是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种细菌性传染病，乂称鸭传染性浆膜炎［1］,是主耍侵害2〜8周龄雏鸭的一种高致病性接触性传染病，目前己成为危害养鸭业的主要病原之一［2］；该菌主要侵害雏鸭，很多报道也都是从发病雏鸭中分离到该菌［3,4］,动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室从某鸭场淘汰的400多日龄种鸭脑组织分离到一株鸭疫里默氏杆菌，在毒力鉴定试验屮发现为无致病性的菌株，现将相关研究报告如下。1材料与方法1.1主要试剂与仪器TSA、TSB培养基(BD公司)；无支原体胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司）；PT-2000PCR仪、Model3000Xi电泳仪（BioBAD公司）；AgaroseGelDNAExtractionKit、琼脂糖（OMEGA公司）。1.2试验动物1日龄的麻鸭，购自湖北某鸭场，饲养到5日龄确认健康。1.3细菌的分离在无菌条件下，打开淘汰蛋鸭脑部，用接种环化线接种于含5%胎牛血清的TSA平板，37°C烛缸培养18h,进一步挑取疑似菌落进行纯化培养。1.4分离菌株的鉴定1.4.1形态及染色特性将纯化培养的疑似菌株进行革兰氏染色，光学显微镜下观察细菌的形态和染色特性。1.4.2生理生化试验挑取典型菌落接种于含有5%胎牛血清的TSB培养基中，37°C摇床培养18〜24h,取少量菌液滴加到H2S、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白陈水、葡磷月东水、枸椽酸盐、触酶、半固体琼脂、葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、氨基酸对照、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木糖等16种细菌生化鉴定管中，置于37°C恒温培养箱中培养，按照所购鉴定管的说明书操作，观察细菌的生化特性。1.4.3PCR鉴定及产物纯化根据文献［5］的RA16SrRNA基因序列，合成引物Pl、P2,目的片段为662bpo上游引物（P1）：57-CAGCTTAACTGTAGAACTGC-37,下游引物（P2）：5’-TCGAGATTTGCATCACTTCG-37,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为：5uL10Xbuffer（含Mg2+）,2uLdNTPs,1uL上游引物，1UL下游引物，2UL模板，0.5uLTaq酶，17.0MLH20；反应条件：95€预变性5min；94°C变性1min,55°C退火30s,72°C延伸90s,35个循环；最后72°C延伸8min,4°C保存。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后，切下目的片段，用AgaroseGelDNAExtractionKit纯化回收DNA。1.4.4测序与序列分析扩增出的目的基因片段回收后送往北京英骏公司测序。测序结果用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）在线进行同源搜索。1.4.5毒力测定将分离的纯化菌株挑单个菌落接种到TSB（含2%犊牛血清）上，37°C振荡培养18h,然后10倍数量级倍比稀释后每个稀释度涂布3个平板做细菌计数。然后用无菌生理盐水,将菌液稀释至1X1010、1X109、1X108.1X107CFU/mL4个稀释度,每个稀释度腿部肌肉多点注射0.5mL；以RAXY强毒株（本实验室分离保存）为阳性对照，用无菌生理盐水将菌液稀释至1X109、1X108、1X107、1X106CFU/mL；生理盐水作空白对照，接种后每天观察数次，连续观察7d,记录各组雏鸭的发病、死亡情况。2结果与分析2.1细菌分离鉴定及革兰氏染色经37°C烛缸培养18h后，TSA固体培养基上长出白色凸起的圆形小菌落，对着光线可见菌落为透明且有特殊折射光。纯培养物经革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性短杆菌。2.2生理生化特性纯化菌株不能发酵各种糖类，枸椽酸盐和触酶阳性，具休结果见表1。2.3PCR鉴定结果JLLY菌株进行PCR扩增后产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现660bp左右的目的片段(图Do2.4序列测定及分析将PCR扩增产物的测序结果经BLAST(http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在线进行同源搜索,结果表明，JLLY菌株的16SrRNA序列与已报道的鸭疫里默氏杆菌同源度...