斑马鱼SAA蛋白原核表迖、抗体制备及菌结合试验4.江西中医药大学生物化学教研室，南昌330004)摘要：通过构建斑马鱼(Daniorerio)SAA原核表达载体，在大肠杆菌(E.coli)TB1中诱导表迖并纯化获得了斑马鱼SAA融合蛋白，将纯化的斑马鱼SAA蛋白免疫Balb/c小鼠，制备了特异性多克隆抗血清，并研究了斑马鱼SAA融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明，纯化的斑马鱼融合SAA蛋白能够与5种细菌直接结合，血清效价达到1:2000以上。关键词：斑马鱼(Daniorerio);血清淀粉样蛋白A;原核表达;抗体制备；菌结合：Q789文献标识码：A：0439-8114(2015)02-0382-03D0I：10.14088/jki.issn0439-8114.2015.02.031ProkaryoticExpression,AntibodyPreparationandBacteriaCombiningofSAAProteininZebrafishQILinl,LIJun2,XIANGZhi-ming3,YUYing-cai4(1.RailwayPoliceCollege,Zhengzhou450053，China；2.SchoolofPharmaceutical，Liaocheng---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---University,Liaocheng252000，Shandong,China；3.SouthChinaSeaInstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510301，China；4.DepartmentofBiochemistry激angxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004，China)Abstract:TheSAAfusionproteininzebrafish(Daniorerio)wasexpressedinE.coliTB1andpurifiedaccordingtotheconstructionofprokaryoticexpressionvector.ThespecificpolyclonalantibodieswereraisedinBalb/cmouseimmunizedwiththepurifiedrecombinantprotein.Thebacteriaconjugationabilityandthevalueofpolyclonalantibodiesweredetected.TheresultsshowedthatthepurifiedSAAproteininzebrafishwasfoundtocombinetogetherwith5bacteria.Thevalueofobtainedantibodieswasupto1:2000.Keywords:zebrafish(Daniorerio)；SAA；prokaryoticexpression；antibodypreparation；bacteriacombining血清样淀粉A(SerumamyloidA,SAA)为高度异质性蛋白［1］，因与一系列疾病相关而成为病理学研究的热点。SAA基因的多态性是淀粉样病变的高危因素，持续高水平SAA是淀粉样病变发生的前提条件［2］。除此之外，SAA与胃癌---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---［3］、直肠癌［4］、胰腺癌［5］、肺癌［6］和绒毛膜癌［7］等恶性肿瘤呈正相关，并将SAA作为癌症临床常规检查的非特异性肿瘤标志物以及手术后康复程度的指标是可行的。人源SAA可以通过NF-KB信号通路诱导细胞间黏附分子1(Intercellularadhesionmolecule1，ICAM-1)的表迖而募集白细胞［8］。本研究中在克隆获得全长斑马鱼(Daniorerio)SAA的基础上［9］，构建融合表达载体，在大肠杆菌TB1中表达斑马鱼SAA并进行纯化，将纯化蛋白进行菌结合试验并免疫Balb/c小鼠制备了特异性多克隆抗体，为后续免疫及肿瘤病理学试验打下基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1载体与菌种原核表迗载体pMal-c2x、大肠杆菌(E.coli)表达宿主菌TB1和AmyloseResin多糖树脂购自NewEnglandBiolabs公司；pGEM—Tvector贝勾自Promega公司；大肠杆菌DH5a、野生型大肠杆菌K12、副溶血弧(V.parahaemolyticus)、溶澡酸弧菌(V.alginolyticus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球(S.epidermidis)均为铁道警察学院生化快速鉴别实验室常规保种。1.1.2试剂琼脂糖胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒为Omega公司产品；T4DNA连接酶、Taq酶、DNAmarker、---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---限制性内切酶EcoRl和Xbal为宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白Marker为Fermentas公司产品；碱性麟酸酶羊抗鼠IgG购自美国安玛西亚公司；NC膜购自PALL公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2原核表达载体pMal-c2x~SAA的构建使用Primerpremier5.0软件设计上、下游引物，以pGEM-T-SAA为模板进行PCR扩增，其中上游引物序列：5'-TTTGAATTCATGAAGCTTCTTCTTG-37,下游引物序列：5，_TTTTCTAGATATGGGCAGGCCTTTA-3,oPCR反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性20s，56°C退火30s，72°C延伸...