神经外科学专业优秀论文MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synucleinPC12细胞的毒性作用及DAT膜表达的影响关键词：N-甲基-4-苯基吡啶离子SNCA基因真核表达载体α突触核蛋白A53T突变PC12细胞摘要：第一部分：含人野生型及其致病突变基因A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体的构建目的：构建含人野生型及其致病突变基因A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体。方法；以RT—PCR方法从人胎脑中克隆野生型SNCA基因；利用单核苷酸差异引物定点诱变法通过PCR构建SNCA基因编码区EcoRⅠ与BamHⅠ位点的同义突变与Ala30Pro（GCA突变为CCA）、Ala53Thr（GCA突变为ACA）致病突变；利用EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切法构建含人野生型及其致病突变基因A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体pEGFP—C3—SNCA。结果:以重组质粒pEGFP—C3—SNCA为模板，通过PCR可扩增到481bp的目的基因片段；以EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切重组质粒pEGFP—C3—SNCA可得到460bp的目的基因片段；最终以三种重组质粒pEGFP—C3—SNCA的转化菌送基因公司测序证实成功。结论:成功构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP—C3—SNCA。第二部分:重组真核表达载体pEGFP—C3—SNCA在高分化型PC12细胞中的稳定转染目的:以成功构建的SNCA基因WT及A30P与A53T突变型重组真核表达载体pEGFP—C3—SNCA，稳定转染高分化型PC12细胞。方法:以重组质粒pEGFP—C3—SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞；以G418筛选转染的PC12细胞；用有限稀释法进行亚克隆，将单克隆的PC12细胞扩大培养备用；以RT—PCR、Westernblot及荧光显微镜鉴定稳定转染PC12中SNCA基因的表达。结果:对于稳定转染目的基因的PC12细胞，RT—PCR方法检测到481bp的目的基因；Westernblot可检测到40KDa的GFP—SNCA的目的融合蛋白；荧光显微镜可观察到绿色荧光。结论:通过稳定转染，成功获得有同义、A30P与A53T突变SNCA基因稳定表达的单克隆PC12细胞株。第三部分:MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞的毒性作用目的:研究MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞的毒性作用。方法:以稳定转染pEGFP—C3的PC12细胞作为对照组细胞，通过MTT法检测细胞活力，AnnexinV—FITC—PI染色后荧光显微镜检测细胞的凋亡，光镜观察活细胞一般形态学变化，透射电镜观察细胞超微结构改变，DCF—DA法检测细胞ROS水平，来观察MPP+对细胞的毒性作用。结果:（1）MPP+处理后各组细胞活力比较，WT组高于对照组，A30P与A53T组低于对照组；（2）MPP+处理后各组细胞凋亡指数比较，WT组低于对照组，A30P与A53T组高于对照组；（3）MPP+处理后各组细胞光镜形态变化，WT组不显著，A30P与A53T组细胞形态变化明显；（4）各组细胞超微结构，MPP+处理前，A30P、A53T组PC12细胞细胞内溶酶体及自噬体增多；MPP+处理后，A30P、A53T组细胞可见各种凋亡改变，而WT组细胞仅可见自噬和晚期溶酶体，无明显凋亡改变。（5）MPP+处理后WT组细胞ROS水平上升幅度低于对照组细胞，而A30P、A53T组高于对照组细胞，以A53T组细胞更甚。结论:过表达人野生型α突触核蛋白保护PC12细胞对MPP+的毒性反应，过表达人A30P与A53T致病突变α突触核蛋白加重PC12细胞对MPP+的毒性反应。第四部分:MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞DAT膜表达水平的影响目的:---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---研究MPP+对过表达人野生型及致病突变A30P、A53T的α突触核蛋白的PC12细胞DAT膜表达水平的影响。方法:Westernblot检测α突触核蛋白蛋白表达水平；以131I—FP—β—CIT与膜DAT结合的放射活度反映细胞膜DAT水平；生物素化膜蛋白方法检测DAT膜表达；Realtime—PCR定量检测DAT和α—SynucleinmRNA的转录水平；激光共聚焦显微镜下观察各组PC12细胞株α突触核蛋白与DAT的共定位。结果:（1）Westernblot检测示各组细胞MPP+处理后α突触核蛋白的蛋白表达增高。（2）131I—F—β—CIT的结合实验示MPP+处理后各组细胞株放射性活度降低；相同MPP+处理水平下WT组均低于对照组，A30P组未用MPP+处理时...