生物化学与分子生物学专业毕业论文[精品论文]苏云金杆菌aiiA基因的克隆及其表达产物抗细菌性病害研究关键词：aiiA基因生物信息学可溶性表达酶动力学植物病害防治摘要：植物致病性病原菌最主要为革兰氏阴性细菌，其自身代谢产物N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactones，AHL)，是一类革兰氏阴性细菌群体致病性应答系统中的关键信号分子。当菌群中AHL累计到一定浓度后，就能激活病原菌致病基因表达，产生致病性并出现各种相关的病症。因此降低病原菌AHL的浓度将成为防治这些病害的关键。目前已从芽胞杆菌等克隆出aiiA基因，并发现其表达的产物可以降解AHL，从而大大减弱致病菌的危害。本研究克隆了来自苔藓、土壤和植物叶片中分离的苏云金芽胞杆菌中aiiA基因，即aiiA-B15、aiiA-B19、aiiA-S2、aiiA-S9、aiiA-P4、aiiA-P28，并对其编码的AHL-Lactonase蛋白进行了生物信息学分析。结果表明这些蛋白均为弱亲水性蛋白，含有3个典型的保守结构域，均属于β-内酰胺酶超家族的结构域。从计算机模拟的三级结构可以看出，AHL-Lactonase蛋白中的His-104、His-106、Asp-108、His-109、His-169、Asp-191、Tyr-194、His-235在空间结构上相互靠近，形成一个较为致密的与甘油结合的结构域，是重要的活性中心。6个α螺旋位于外侧，形成活性中心的表面保护层。通过比较16SrRNA基因和AHL-Lactonase蛋白的进化树，表明aiiA基因编码的AHL-Lactonase蛋白与Bt物种的进化并不同步，在该物种的进化过程中aiiA基因可能早于物种的分化；aiiA基因不能作为Bt物种进化的遗传标记。这些预测结果的综合应用不仅为aiiA基因表达、蛋白纯化等后续研究提供了大量宝贵的信息，并为改造AHL-Lactonase酶学特性，提高AHL-Lactonase的抗病能力等工作提供有价值的参考。本研究首先选用了pGEX-4T-3表达载体，构建重组质粒pGEXaiiA-B15，获得BL21(DE3)-pGEXaiiA-B15工程菌。表达条件的优化表明，在0.6mmol/LIPTG、30℃下诱导3h，蛋白的表达量最大，但绝大多数为包涵体。接着利用pET-29a构建了pET29a-aiiA融合表达载体，制备E.coliBL21(DE3)-pET29a-aiiA工程菌，在0.8mmol/LIPTG、20℃，25h下诱导表达，获得了54.4μg/mL可溶性AHL-lactonase-B15蛋白，并采用亲和层析的方法纯化AHL-lactonase-B15。AHL-lactonase-B15对胡萝卜软腐欧文氏杆菌抗病性实验表明，AHL-lactonase-B15具有较好的抗病性，明显抑制了马铃薯的腐烂。值得注意的是，BL21(DE3)-pET29a-aiiA工程菌诱导表达后超声破壁的上清液样品也具有很好的水解AHL的活性和抗病性。这表明AHL-lactonase-B15在浓度较低并存在很多杂蛋白的情况下仍然有较强的活性。这也提示了AHL-lactonase-B15具备作为新型高效无公害的生物农药的潜能，具有进一步深入研究价值。AHL-lactonase-B15酶学特性表明，AHL-lactonase-B15酶促反应最适温度在40℃左右，最适pH约为8。以上研究结果为AHL-Lactonase蛋白质工程研究、微生物抗细菌病害基因工程育种、大规模发酵生产及其实际生产应用提供理论依据，对提高果蔬品质和产量、减少化学农药污染，实现经济效益、社会效益和生态效益的同步增长，具有重要的理论意义和实际应用价值。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---正文内容植物致病性病原菌最主要为革兰氏阴性细菌，其自身代谢产物N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactones，AHL)，是一类革兰氏阴性细菌群体致病性应答系统中的关键信号分子。当菌群中AHL累计到一定浓度后，就能激活病原菌致病基因表达，产生致病性并出现各种相关的病症。因此降低病原菌AHL的浓度将成为防治这些病害的关键。目前已从芽胞杆菌等克隆出aiiA基因，并发现其表达的产物可以降解AHL，从而大大减弱致病菌的危害。本研究克隆了来自苔藓、土壤和植物叶片中分离的苏云金芽胞杆菌中aiiA基因，即aiiA-B15、aiiA-B19、aiiA-S2、aiiA-S9、aiiA-P4、aiiA-P28，并对其编码的AHL-Lactonase蛋白进行了生物信息学分析。结果表明这些蛋白均为弱亲水性蛋白，含有3个典型的保守结构域，均属于β-内酰胺酶超家族的结构域。从计算机模拟的三级结构可以看出，AHL-Lactonase蛋白...