基于ISSR标记的浙江主要茶花品种亲缘关系及DNA指纹图谱研究正文报告一、项目研究意义1、浙江省茶花产业的发展状况及在产业发展中面临的主要问题茶花（Camelliajaponica）是世界名优花卉之一，是我国的十大名贵花卉之一，也是我省金华、宁波、温州三市的市花。我省在茶花品种的收集、培育及产业化示范方面已处于全国领先水平。1997年，金华被农业部命名为全国唯一的中国茶花之乡；2003年第十八届国际茶花大会在金华召开，使我省茶花在国内外都获得了很高的知名度。2005年，全省茶花种植面积达10万多亩，有10多万花农种植茶花，年产茶花800多万盆，培植种苗3000多万株，年产值达25亿元。目前，我国的茶花品种约300余个（庄瑞林，1989），其中我省茶花除原种外，在金华、宁波、温州等地经过长期的人工栽培、杂交和选种，培育出200余个有地方特色的传统茶花品种；另有国外引进的400余个品种(高继银，1999)。我省近年茶花产业蓬勃发展，但在发展中也出现了以下几个问题：（1）品种混杂、谱系不明，亲缘关系不清，导致新品种选育亲本选配的盲目性大，育种效率比较低，育成品种遗传背景趋于单一，不利于保持品种的遗传多样性。（2）茶花多为无性繁殖，新品种进入市场后，由于缺乏有效的品种鉴别手段，难以开展技术监督和管理，知识产权得不到有效的保护，大大损害了品种选育单位及育种家的积极性。（3）在种苗销售过程中，由于仅靠苗期的形态性状难以辨别品种的真伪，容易出现种苗假冒现象，严重损害花农利益。为了尽快解决这些问题，提高浙江茶花的质量和市场竞争力，应对我省主要茶花品种间的亲缘关系进行系统的研究，以减少育种过程中亲本选配的盲目性，提高育种效率；同时找出一种操作简单、成本低廉、结果可靠的方法和技术，对山茶品种进行快速、准确的鉴别，为新品种保护或假冒品种鉴别提供技术证据。2、山茶品种间亲缘关系及品种鉴别方面的研究现状及ISSR分子标记技术长期以来国内有关茶花品种的研究，多集中在对茶花野生资源调查（李宝华2003；李纪元等，2002）、资源的收集、整理、栽培技术、杂交育种（陈新年，1999）、组织培养、嫁接繁殖等方面的研究上，对茶花品种间的亲缘关系、品种鉴别一直以来都是依据其花的形态结构和生理性状(陈清炮，1992)，而在分子水平上对茶花品种间的亲缘关系、遗传分析与鉴别等方面的研究至今未见报道。目前在植物亲缘关系和DNA指纹图谱研究中可以利用的有RAPD、AFLP、RFLP和ISSR等多种分子标记。但前三种标记均存在一定的局限性，RAPD的扩增结果稳定性和重演性较低，AFLP、RFLP的技术要求高，成本高难以在一般的实验室普及与应用。而ISSR分子标记即简单重复间序列(inter-simplesequencerepeat，ISSR)，是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术，其基本原理是在SSR的5’或3’端加锚l-4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段。因此，ISSR不仅结合了RAPD的通用性，而且具有AFLP、RFLP的大部分优点，是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。利用ISSR分子标记可以在亲缘关系较近的品种间检测遗传差异，评估不同品种间的异质性，计算亲本之间的遗传距离，从而确定亲本之间的遗传关系和亲缘关系，并进而划分杂交优势群，提高杂种优势潜力；同时ISSR分子标记可以用来建立DNA指纹图谱，因在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记，某一品种具有区别于其它品种的独特标记即一些特异性DNA片段的组合就称为该品种的“指纹”，各品种的独特的指纹片段构成该物种的DNA指纹图谱，它具有类似于人的指纹那般的高度个体特异性和稳定性。DNA指纹图谱在植物育种中有广泛应用，因为（1）每个品种DNA指纹差异可直接提供与目标性状有关的DNA水平的信息，避免了环境的干扰，从而能大大提高杂交育种中对亲本及后代理想单株的选择效率，（2）通过检测品种是否只具有该品种特有的标记指纹片段可以很有效地鉴定品种纯度与真伪，以及用于新品种登记和品种知识产权保护等（邹...