绿僵菌胞外蛋白酶Pr1C诱导飞蝗中肠免疫功能分析郭隆隆李贝贝李霜摘要为明确金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae胞外蛋白酶Pr1C在绿僵菌侵染飞蝗Locustamigratoria中肠中的作用，从绿僵菌IMI330189菌株转录组中获得并分析了Pr1C基因全长序列，设计引物对该基因进行了克隆和原核表达。将表达的Pr1C蛋白与绿僵菌IMI330189混合后饲喂处理，测定了混合物对飞蝗的毒力，并通过荧光定量PCR检测了飞蝗中肠免疫相关基因的表达情况。结果显示，该基因属于绿僵菌类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶家族，全长为2126bp，蛋白大小为71kDa。Pr1C與绿僵菌IMI330189混合后可以显著提高对飞蝗的毒力。荧光定量结果表明，Defensin，Persephone，Tube，Relish，Dredd5个基因在各处理中表达量均呈现升高趋势，其中Pr1C蛋白和绿僵菌混合处理的变化比其他处理组变化快，于第2天达到较高水平;绿僵菌处理变化较慢，于第6天达到最高水平。本研究表明，绿僵菌胞外蛋白酶Pr1C可显著提高绿僵菌毒力，促进绿僵菌侵染速率，为进一步研制和应用生物制剂防治飞蝗提供理论依据。关键词绿僵菌;胞外蛋白酶;飞蝗;毒力：S476.12：ADOI：10.16688/j.zwbh.2019075AbstractInordertoexploretheroleofMetarhiziumanisopliaeinthemidgutinfectionofLocustamigratoria，thefull-lengthsequenceofPr1CgenewasobtainedfromthetranscriptomesequencesofM.anisopliaestrainIMI330189andprimersweredesignedtocloneandexpressthePr1Cgene.TheobtainedPr1CproteinwasmixedwithM.anisopliaeIMI330189sporeanditstoxicitytothelocustwascheckedbyusingbait-feedingmethod.Theexpressionlevelofintestinalimmune-relatedgenesinlocustswasdetectedbyfluorescencequantitativePCR.NCBIBlastresultsshowedthatPr1CgenebelongedtotheserineproteasefamilyofM.anisopliaewithafulllengthof2126bp，anditsproteinsizewas71kDa.ThebioassayresultsshowedthatthemixtureofPr1CandM.anisopliaeIMI330189couldsignificantlyincreasethevirulencetoL.migratoria.TheexpressionleveloffivegenesDefensin，Persephone，Tube，RelishandDreddshowedanincreasingtrendinalltreatments，butthetreatmentwiththemixtureofPr1Cproteinandmetarhiziuminducedafasterchangethanothertreatmentsandreachedtothehighestlevelonthesecondday.ThetreatmentwithM.anisopliaeinducedslowchangeintheexpressionofgenes，andthehighestlevelwasobservedonthesixthday.ThisstudyindicatedthattheextracellularproteasePr1CofM.anisopliaecouldsignificantlyincreasethevirulenceofM.anisopliaeanditsinfectionrate，providingatheoreticalbasisforthefurtherdevelopmentandapplicationofbiologicalpreparationsforcontrollingL.migratoria.KeywordsMetarhiziumanisopliae;extracellularprotease;Locustamigratoria;virulence金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae作为一种广泛存在的昆虫病原真菌能够寄生于多种害虫，它主要通过穿透昆虫体表进入寄主体内，消耗营养，产生毒素等方式致死害虫[1]。Kucera在昆虫体壁离体诱导培养条件下首次发现了绿僵菌胞外蛋白酶的活性，并指出菌株的蛋白酶活力与其毒力存在关系[2]。樊美珍等利用该方法，以马尾松毛虫作为试虫，测定了球孢白僵菌胞外蛋白酶的产量与毒力的关系，进一步证实二者之间存在相关性[3]。StLeger等研究发现，胞外蛋白酶Pr1作为一组碱性同工酶[4]，能够作用于昆虫表皮中的天冬氨酸和谷氨酸的羧基，降解蛋白质[5]，在绿僵菌对昆虫致病力方面发挥着重要的作用[6]。StLeger等通过构建超表达Pr1A基因的菌株，发现其对昆虫的致病力显著高于野生型菌株[7];Pr1A和Pr1B基因缺失的自发突变体菌株毒力明显降低[8]。证明Pr1是绿僵菌中重要的毒力因子。Quesada等研究发现绿僵菌胞外蛋白抽提物经口饲喂后会引起海灰翅夜蛾Spodopteralittoralis死亡及中肠结构破坏[9]。本实验室前期研究也发现，绿僵菌饵剂处理飞蝗，可导致飞蝗中肠微绒毛变形肿胀、断裂脱落逐渐稀疏[10]。而饲喂含有绿僵菌和胰凝乳蛋白酶抑制剂（TPCK，Pr1的抑制剂）的飞蝗中...