不同培养方式和pH对草地早熟禾原生质体分裂和生长的影响摘要：以3个草地早熟禾品种午夜II号、新格莱徳和橄榄球II号继代培养20次的愈伤组织为材料，设置不同的pH水平，通过2种培养方式进行了原生质体培养，观测其原生质体的分裂和生长状况。结果表明：3个草地早熟禾品种原生质体最适宜的培养方式为固液双层培养，固液双层培养中液相pH为5.8(新格莱德pH6.0)时原生质体分裂率达最高值，午夜2号42.8%、新格莱徳50.1%和橄榄球2号29.4%。基因型的差异对于原生质体培养成功与否有着密切的关系。关键词：液体浅层培养；固液双层培养；原生质体分裂率；pH中图分类号：S543文献标识码：A文章编号：100975500(2012)01?0050?04草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾属一种优质冷季型草坪草。草地早熟禾抗寒性较差\[1\],植物生殖方式复杂多样,常以兼性无融合生殖方式进行繁殖\[2-6\],有些品种无融合生殖率高达98%以上\[3,6\],有性杂交率低，很难获得杂种优势品种。以原生质体培养为基础和前提条件的体细胞杂交技术不失为选育草地早熟禾杂种细胞可行而有效的育种途径之一。Vander等\[7\]开创了草地早熟禾原生质体培养的先河，Kisten等\[8\]的研究进一步奠定草地早熟禾原生质体培养的基础,但目前来看，早熟禾体细胞杂交技术还不成熟，研究相对不够深入，仅获得一些阶段性成果\[9,10\]。实验以草地早熟禾午夜2号(Midnight.II)、新格莱德(Nuglade)和橄榄球2号(Rugby11)3个品种的优质愈伤组织为材料，研究不同培养方式和pH对原生质体分裂和生长的影响，探索不同品种原生质体的最佳培养方式，以期为进一步完善草地早熟禾的原生质体培养奠定皋础。1材料和方法1.1实验材料将3个草地早熟禾午夜2号、新格莱德和橄榄球2号品种的成熟种子接种于添加各品种诱导愈伤组织适宜浓度激素的MS培养基上(午夜2号:1mg/L2,4?D+0・3mg/L6?BA；新格莱德：3mg/L2,4?D+0.5mg/L6?BA；橄榄球2号:3mg/L2,4?D+0.1mg/L6?BA；),诱导并优化培养得到生长状态质地良好的愈伤组织。1・2实验方法挑选各品种继代20次生长状态良好的愈伤组织1g,置10mL酶液(13%甘露醇CPW+1%的纤维素酚+1%的离析酚+0.3%的崩溃酚+0.3%的果胶酚和5mol/L的MES,pH5.8),25±1°C,50r/min摇床暗中酶解16h。用200目和300目尼龙网过滤混合液，离心5min,依次用CPW?13溶液和原生质体培养液清洗2〜3次后用培养液调整原生质体密度为2X105个/mL后进行培养\Ell\Jo用液体浅层培养和固液双层培养进行草地早熟禾原生质体培养。其中，液体浅层培养以KM8P为基本培养基，添加不同品种各自愈伤组织诱导时适宜浓度的激素（0.45Um微孔滤膜抽滤灭菌），将纯化得到的原生质体悬浮于其中，滴加2inL悬浮液到直径6cm的培养皿底部，形成一薄层，用保鲜膜封口，于26±1°C下，恒温培养箱中静置培养；固液双层培养法：在培养皿底部先铺8〜10mLMS培养基（不添加激素，pH5.8）,再在上面滴加2讥含有原生质体的KM8P培养液进行浅层培养，用保鲜膜封口，于26±1°C下恒温培养箱中静置培养，每天轻轻晃动培养皿数次，使原生质体与氧气充分接触。KM8P培养液的pH值设置5.6、5.8、6.0共3个水平。原生质体培养15d后在倒置显微镜下统计分裂频率。比较不同品种的草地早熟禾原生质体的分裂生长及再生能力差异。原生质体分裂频率（%）二（分裂的原生质体数/接种原生质体数）X1002结果与分析2.1不同培养方式及培养基pH对3个品种原生质体分裂的影响培养方式和培养基的pH对午夜2号原生质体的分裂生长均有影响。固液双层培养比液体浅层培养更能得到较高的原生质体分裂率（图1）o2.23个草地早熟禾品种原生质体形态及其变化原生质体培养初期，3个草地早熟禾品种的原生质体状态基本相似，在倒置显微镜下观察均表现为形状规则、边缘清晰、大小均一和内含物较多的特性（图4A）。培养2〜3d后，可观察到原生质体再生细胞的第1次、第2次分裂（图4B,C）o随后再生细胞持续分裂，在低倍镜下即可观察到再生细胞形成的小细胞团（图4D）。比较3个品种原生质体分裂率发现，新格莱德原生质体的分裂率最高（图2）,午夜2号略低于新格莱德（图1）,而橄榄球2号原生质体的分裂率远低于前两者（图3）。3讨论3.1不同培养方式对原生质...