马尾松毛虫腺苷酸转移酶基因的克隆与分析翁宏飚1，牛宝龙1，何丽华1，沈卫锋1，王守先1，2，吾中良3，蒋平3，孟智启1（1浙江省农业科学院蚕桑研究所昆虫分子生物学实验室，杭州310021；2浙江林学院，浙江临安311300；3浙江省林业有害生物防治检疫局，杭州310020）摘要：【目的】克隆马尾松毛虫腺苷酸转移酶基因。【方法】采用RACE方法克隆基因，利用软件分析推导蛋白的保守结构域，并与已报道的其它8种昆虫腺苷酸转移酶进行比较，并构建系统树，用southern法分析该基因在单倍体基因组中的拷贝数。【结果】获得马尾松毛虫腺苷酸转移酶基因全长cDNA（GenBank登录号：EF194157），该基因无内含子，在烟草天蛾(M.sexta)、棉铃虫（H.armigera）、家蚕（B.mori）蜜蜂(A.mellifera)、绿蝇(L.cuprina)、果蝇(D.melanogaster)、蚊子(A.gambiae)等昆虫间高度保守。基因组酶切后呈单一Southern杂交带。【结论】马尾松毛虫松毛虫腺苷酸转移酶基因高度保守，在基因组中单拷贝存在。关键词：松毛虫；腺苷酸转移酶；克隆CloningandPrimaryStudyofAdenineNucleotideTranslocaseGeneinDendrolimuspuntatusWENGHong-biao1,NIUBao-long1,HELi-hua1,SHENWei-feng1,WANGShou-xian1,2,WUZhong-liang3,激ANGPing3,MENGZhi-qi1(1LaboratoryofEntomo-MolecularBiology,Zhe激angAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021;2Zhe激angForestryUniversity,Lin’an311300,Zhe激ang;3ForestPestControlandQuarantineBureanofZhe激angProvince,Hangzhou310020)Abstract:【Objective】AcomplementaryDNAcloneencodingtheadeninenucleotidetranslocasesinDendrolimuspuntatushasbeenidentified.【Method】RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)methodwasusedtogetthecompletecDNAsequence.Thesequencewasanalyzedwithsoftware.【Result】ThefulllengthofadeninenucleotidetranslocasescDNAwascloned.(GenBankaccessionnumber:EF194157).Thesequencecontainsasingleopenreadingframethatencodesapolypeptide300aminoacidsinlength.Thispolypeptideshowsextensivesimilaritiestotheknownekaryotictranslocasepolypeptides,thesimilaritybeinggreatest(upto80%identity)totheLepidopteraADP/ATPtranslocases.【Conclusion】AdeninenucleotidetranslocasesofDendrolimuspunctatushashomologywiththatofotherinsects.Southernblotanalysissuggeststhatasinglecopyofthisgeneispresentperhaploidgenome.Keywords:Dendrolimuspunctatus;Adeninenucleotidetranslocases;Clone0引言【研究意义】线粒体是细胞内主要的ATP生产中心，在细胞凋亡、信号转导的发生过程中起着非常重要的作用。腺苷酸转移酶（adeninenucleotidetranslocase，ANT）是真核细胞的线粒体内膜上的转运蛋白家族成员[1~3]，在线粒体内膜上分布最为丰富，约占细胞线粒体内膜总蛋白的10%[1]，作为重要代谢物的载体，参与线粒体的各种活动[3]。马尾松毛虫是中国重要的经济林害虫，开展松毛虫腺苷酸转移酶研究，有利于解析害虫生命代谢网络、了解ANT保守结构在昆虫进化中的意义，同时对新农药的研制具有一定的指导作用。【前人研究进展】ANT蛋白由两个完全相同，分别含一个ATP/ADP结合位点的亚基组成，通过其构象的变化，实现细胞质中ADP和线粒体内ATP间的跨膜交换[2,4,5]，是生物体内能量产生与能量消耗的重要连接[6]，生物体大约1/2～1/3的基础电子传递由ANT催化，是保持细胞内能量代谢的关键成分[7,8]。ANT虽非组成线粒体内膜上通透转换孔洞的必要成分，但与内质网与线粒体之间的Ca2+离子转移有关，参与线粒体Ca2+离子内环境平衡[9,10]。近来的研究表明，ANT在细胞凋亡诱导过程中有重要作用[11,12]，是各种细胞凋亡因子或凋亡抑制因子的作用靶位[13~16]，细胞内具氧化活性的细胞凋亡诱导因子通过氧化ANT蛋白的巯基基团，诱导线粒体肿胀和线粒体内的SOD、细胞色素C的释放[17]，而细胞色素C则可激活细胞凋亡代谢阶梯[4,18]。大多数真核生物至少有2个不同的基因编码ANT蛋白[7]，在从真菌到哺乳动物的已经研究中，ANT蛋白无论在一级还是在高级结构上均高度保守，...