产B—甘露聚糖酶菌株育种及培养基优化摘要：利用实验室筛选保藏最高酶活为10.7U/inL的白腐真菌作为出发菌株，进行紫外诱变育种及培养基优化，以期提高菌株产0-廿露聚糖酶能力。结果表明，紫外诱变条件为抱子悬液浓度106〜107个/inL,诱变时间10min,此条件下的抱子致死率达78%,获得了13株正向突变株,经6代遗传稳定性试验证明UV-2突变株酶活最高，遗传稳定性最强，比出发菌株酶活提高了2.075倍。通过单因素试验确定了该突变株的最佳碳源、氮源分别为魔芋粉和硝酸鞍，对酶活影响较人的无机盐为磷酸二氢钾。通过正交试验，确定了最佳产酶培养基为魔芋粉4.0g/L.NH4N035.0g/L、KI12P045.0g/L、NaCl1.0g/L>MgS04•711201.0g/L,在此条件下测得甘露聚糖酚最大酚活为46.17U/mL,比优化前提高了40.3%。关键词：廿露聚糖酶；白腐真菌；诱变；正交试验；培养基优化中图分类号：Q933；Q93-335文献标识码：A文章编号：0439-8114(2013)16-3820-04在世界能源日益短缺的形势下，植物纤维作为可再生有机资源越来越受到重视，其主要成分为纤维素、木质索和半纤维索。半纤维素约占植物干重的35%,含量是仅次于纤维素的杂聚物生物资源，其中最具代表性的两种半纤维素是木聚糖和甘露聚糖［1］。B-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)可降解甘霧聚糖、葡萄甘霭聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的0-1,4-D-毗喃甘露糖主链［2］。微生物来源的(3-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点[3],近年来随着人们对自然界中半纤维素资源的开发和对甘露低聚糖保健价值的发现，微生物甘露聚糖酶再次成为研究热点[4-6]o不同来源的P-甘露聚糖酶对不同底物的作用程度及其水解产物是不相同的[7-9]o廿露聚糖酶具有广泛的工业应用价值，可用于饲料、食品、轻工和石油行业等[4,6-9]o试验利用江苏省生物质转化与过程集成工程实验室保藏的口腐真菌，釆用紫外诱变的方法使出发菌株酚活提高，并采用正交试验进行培养基的优化以进一步提高酶活，以期为甘露聚糖酶的进一步研究打下基础。1材料与方法1.1材料菌种：口腐真菌，由江苏省生物质转化与过程集成工程实验室筛选保藏。仪器：LDZX型自动立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）;RCM-1000超净工作台（上海和呈仪器制造有限公司）；QYC-211恒温摇床（上海福玛实验设备有限公司）；721型分光光度计（上海棱光技术有限公司）。1.2培养基及配制方法1）固体斜面培养基：PDA培养基。2）筛选培养基：魔芋粉5.0g,NaCl2.0g,琼脂20.0g,加去离子水至1000inL,pH6.0[10]o3）发酵产酶液体培养基：魔芋粉5.0g,蛋白月东5.0g,KII2PO41.0g,NaCl1.0g,MgS04-7H201.0g,加去离子水至1000mL,pH6.0。1.3试验方法1.3.1培养条件种子培养基和产酚培养基均在250mL三角瓶中装液100mL,摇瓶中加入10颗玻璃珠。摇瓶培养条件均为26°C、150r/mino种子培养时间为24h,接种量为10%。1.3.2B-甘露聚糖酚酶活测定方法1）甘露糖标准曲线的绘制。取0.01mo]甘露糖，用0.05mol/L的醋酸钠缓冲液（pH4.5）溶解定容至100mL,制成浓度为100uinol/mL的甘露糖储备液。分别移取100Pmol/inL的甘露糖储备液至100mL容量瓶中，用去离子水配制成浓度分别为1、2、3、4、5、6umol/mL的甘露糖溶液。分别在不同试管中各移取1.00mL上述6种不同浓度的甘露糖溶液及1.00mL缓冲溶液，再分别添加DNS2.00mL,沸水浴5min,取出冷却至室温，加去离子水10.00mL,在540run处测定吸光度[11,12]。2）粗酶液的制备。取发酵液8000r/inin离心10min,上清液即为粗酶液。3）甘露聚糖酶活力的测定。将魔芋粉溶于pH6的磷酸钠缓冲液中配制20g/L的溶液作为底物，在0.9mL底物中加入0.1mL适当稀释的粗酶液,于50°C水浴反应10minE2],加入DNS试剂2.0mL,沸水浴5min显色，立即以流动水冷却至室温，加去离子水定容至10.00mL,以空白液调零，在540nm处测定吸光度。每分钟产生1Mmol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位（U）[11,12]o计算公式如下：U二NXG/（LXT）式中，N为酶液稀释倍数，G为酶解液中还原糖含量，L为加酶量，T为酶解时间。1.3.3紫外诱变方法取培养3d长满成熟抱子的斜面，用无菌生理盐水将抱子洗下，制成抱子悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，将...