脐血间充质干细胞分离培养鉴定和诱导分化探究［摘要］目的：分离培养人脐血间充质干细胞(humanumbilicalcordblood-derivedmesenchymalstemcells,hUCB-MSC),体外观察其生长特性，并在特定条件下诱导分化，探讨其成脂成骨分化能力。方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物；用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力。结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增值能力，流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等，不表达造血标志CD34和CD45；成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性；成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性。结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记，具有成骨成脂分化潜能。［关键词］脐血；间充质干细胞；分化；鉴定［中图分类号1Q813.1［文献标识码］A［文章编号11008-6455(2013)07-0735-04间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),作为一种成体干细胞用于再生医学修复各种间叶组织如骨、软骨、肌肉等，具有广阔的发展空间［1-2］,目前应用较为广泛为骨髓间充质干细胞，但由于骨髓取材属有创操作且干细胞随供体年龄增大有老化倾向等问题，在一定程度上限制其临床应用［3］。与骨髓间充质干细胞相比，脐血干细胞来源广泛，采集方便，不会对供者造成任何伤害，且有研究显示患者接受异体移植后，脐血来源的MSCs显示出更低的免疫原性反应［4-5］所以人脐血MSCs引起越来越多研究者的广泛兴趣。但是关于间充质干细胞的含量及能否成功体外培养存在很大争议。因此，本实验即探讨hUCB-MSCs的分离培养及其生物学特性，以期建立稳定的体外分离培养体系；同时对其体外诱导分化能力也进行深入研究，以期为下一步研究奠定实验基础。1材料和方法1.1材料：所有标本均取自哈尔滨医科大学附属第一临床医学院妇产科顺产及剖宫产的胎儿，孕妇体健，乙肝五项、梅毒等检测均为阴性，胎儿无先天性疾病，取血前征得产妇及家属同意并签署知情同意书。0.25%胰蛋白酶/EDTA、DMEM/F12（美国,Hyclone）,胎牛血清FBS（美国,Gibco）,人淋巴细胞分离液（1.077g/ml,天津TBD公司），地塞米松、维生素C、11引垛美辛、0-甘油磷酸钠、3-异丁基-1-甲基黄嗥吟（IBMX）和胰岛素均购自美国Sigma公司。荧光标记小鼠抗人单克隆抗体：CD45-PE.CD34-APC.CD90-FITC、CD105-FITC和CD73-PE均购自美国biolegend公司。1.2方法1.2.1hUCB-MSC的分离与培养［6］：经新生儿父母同意,采集新生儿脐血12份，每份50〜80ml,将所采集样本于4h内处理。将抗凝脐血用同体积的PBS稀释一倍，混匀，再与37*预温的3%明胶等比混合，室温下静置至血浆与红细胞界面形成后，吸取血浆层，2000r/min离心5min,收集细胞；用5mlDMEM/F12重悬所得细胞，按2：1的体积比加到人淋巴细胞分离液(1.077g/ml)表面，2000r/min离心20min,离心后吸取悬于分离液面的白膜层，获得单个核细胞。PES洗两次，用DMEM/F12培养基(含体积分数为10%胎牛血清、10ug/L碱性成纤维细胞生长因子bFGF、100U/mL青霉素和100g/L的链霉素)悬浮上述细胞，计数，以lX107cells/ml浓度接种于25ml培养瓶，置于37°C,5%C02饱和湿度的培养箱中培养。4天后首次换液，以后每3天换液一次。倒置显微镜下观察细胞生长情况。细胞生长至80%融合时，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1：1传代。第一代后细胞生长达到80%〜90%时按1：3传代。选用生长良好的P3代细胞做鉴定。1.2.2流式细胞仪检测细胞周期：取P3代细胞，0.25%胰酶/EDTA消化，制备单细胞悬液，并调整细胞数为1X106个，70%冰乙醇固定30min,PBS洗2次，40mg/LRNAse中处理后离心，加入10g/L碘化丙噪0.5ml,染色30min,流式细胞仪检测细胞周期。1.2.3hUCB-MSC表面标志的检测：取P3代细胞，在细胞达到80%融合时，0.25%胰酶/EDTA消化，制备单细胞悬液,并调整细胞数为1X106个，PBS洗两次，离心，弃上清，加入0.lmlPBS重悬，分别加入荧光标记的抗体及同型对照，室温避光孵育20mino流式细胞仪检测CD90.CD105和CD73、CD45和CD34的表达情况。1.2.4...