中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25(9):84~88长白山药用真菌树舌凝集素的纯化及生化特性*张春玉黄国辉林景卫孙非许守民刘立侠**（东北师范大学生命科学学院长春130024）摘要用硫酸铵分级沉淀、离子交换和HPLC层析等方法，从长白山药用真菌树舌的菌丝体中分离纯化了一种凝集素（Ganodermaapplanatumlectin，简称GAL），SDSPAGE检测其为单一蛋白条带。经过SDS-PAGE测得其亚基分子量为15kDa左右，HPLC分析分子量为58kDa左右，表明GAL由4个亚基组成。氨基酸组成分析表明，GAL中甘氨酸含量较高，不含蛋氨酸和色氨酸，中性糖含量约11.2%。圆二色CD谱显示其含有3.6%的α螺旋、46.8%的β转角和49.6%无规则卷曲，不含有β折叠。GAL可以凝集供试的2种动物血和3种血型人血的血红细胞，但对不同来源的血红细胞凝集滴度不同。糖抑制实验表明，只有棉籽糖和D-松三糖部分抑制GAL的凝血活性。GAL具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca2+、Mg2+和Zn2+等二价阳离子的影响。关键词树舌凝集素生化特性血凝集活性收稿日期：20050627修回日期：20050805*国家留学青年资助基金(2003),吉林省科技厅重大招标资助项目(200404013)**通讯作者，电子信箱：liulx062@nenu.edu.cn凝集素（Lectin）是一类广泛存在于动植物和微生物中非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地结合，具有凝集血细胞的作用［1］。目前全世界大约有50多种药用真菌凝集素被纯化，其分子量为12~190kDa，含糖量为0%~18％［2］，这些凝集素能够参与和介导细胞中各种生命现象的调节，尤其是其显著的抗肿瘤作用引起了人们的广泛关注。研究表明从灵芝（GanodermaCapense）、金针菇（Flammulinavelutipes）、杨树菇（Agrocybeaegerita）和口蘑（Tricholomamongolicum）等真菌中分离的凝集素都具有很强的抗肿瘤活性［3~6］。由此可见，凝集素是药用真菌的一种主要药理成分。长白山区具有丰富的食用和药用真菌资源，其特产的树舌是具有较高药用价值的大型真菌本文报道了从长白山来源的树舌菌丝体中分离出天然的凝集素成分，分析了其理化性质、血凝集活性和特点，为药用真菌树舌中生物活性物质的研究和利用提供依据。1材料与方法1.1材料树舌菌种购自吉林农业大学菌物所；小白鼠和家兔购自吉林省生物制品所实验动物中心；正常人血由吉林大学再生医学研究所提供，收集的血配成2%的红细胞悬液。DEAESephadexA25为Pharmacia产品；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris和十二烷基磺酸钠（SDS）等化学试剂购于上海生工生物技术有限公司；低分子量标准蛋白为宝泰克产品；糖抑制实验中所用的糖均为Sigma产品；实验中所用其它试剂皆为国产分析纯。1.2方法1.2.1凝集素的分离纯化称取液体培养的树舌菌丝体60g（鲜重），加入10mmol/LTrisHCl(pH8.0)置冰箱浸泡24h，经高速捣碎机匀浆后，四层纱布过滤，滤液在3500r/min条件下离心20min，收集上清液，向其中加入固体硫酸铵达40％饱和度，低---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---温搅拌20min置4℃冰箱过夜。4000r/min条件下离心30min后弃沉淀，继续向上清液中加入固体硫酸铵达90％饱和度，搅拌、放置、离心同前，最后获取的沉淀透析脱盐后得树舌凝集素（GAL）粗品。取DEAESephadexA25经处理后装柱（2.6cm×40cm）用NaCl液平衡，取上述GAL粗提液（浓度为3mg/ml）上柱，流速30ml/h，5ml/tube，0.1~1.6mol/LNaCl洗脱液4℃层析柜进行线性离子梯度洗脱，收集洗脱峰透析冻干后备用，并进行凝血活性检测。1.2.2凝集素在HPLC上的纯化和检测将冻干后样品用10mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶解，经HPLC纯化，条件为：仪器：JapanSHIMADZULC-10AVP系统，检测器：SHIMADZUSPD－10AVP，工作站：CLASS-Vp，色谱柱：TSK-GEL，G3000PWXL，SIL-10ADVP自动进样器进样，流动相0.9%NaCl（pH8.0），流速0.5ml/min，柱温为4℃，压力为1.6mpa,取供试样品（浓度为2mg/ml）1ml，045μm柱头过滤器滤过，设定20μl进样量,记录色谱图。将收集的蛋白峰和记录峰对照进行凝血活性检测，严格收集第1活性峰，透析除盐，冷冻干燥后得GAL纯品。2005,25(9)张春玉等：长白山药用真菌树舌...