一株髙拮抗活性菌株的鉴定及其抗菌活性缺失突变体的获得摘要：本研究以黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)为指示菌，从大豆植物根际土壤中筛选到一株拮抗活性较高的菌株(D-7),经RecA基因序列分析，鉴定其为新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacenocepacia)。经PCR检测，该菌株不存在毒性基因BCESM(esmR)和cblAo致病性分析发现该菌株对苜蓿幼苗和洋葱没有致病性。为了解该菌株的抗菌物质合成相关基因，利用Tn5转座子突变法构建菌株D-7的突变体库，并筛选获得10株对黄瓜枯萎病菌抗菌活性减弱的突变体。对各突变株插入位点分析发现，其中5个突变株的Tn5转座子插入到同一基因，该基因编码葡萄糖抑制的分裂蛋白A(Glucose-inhibiteddivisionproteinA,GidA),其余5株突变体的插入位点分别位于不同的基因上，编码的蛋白包括糖基转移酶(Glycosyltransferase)、II型分泌系统蛋白(typeIIsecretionsystemprotein)等，表明菌株D-7的抗真菌能力有多个基因参与。关键词：新洋葱伯克霍尔德氏菌；拮抗活性；突变基因中图分类号：S182文献标识号：A文章编号：1001-4942(2018)07-0126-07AbstractAbacteria.strainD~7wasisolatedfromsoybeanrhizospheresoilandshowedhighantimicrobialactivitytoplantpathogenicfungiandbacteria,suchasFusariumoxysporumandRaistoniasolanacearum.ThestrainwasidentifiedtobeBurkholderiacenocepaciabasedonRecAgenesequenceandphylogeneticanalysis・SpecificPCRwasconstructedtoamplifyvirulencegenes,suchasBCESM(esmR)andcblA,andtheresuItsshowedthestrainD~7didnothavethetwogenes・Italsohadnopathogenicitytoalfalfaandonion.InordertounderstandthegenesrelatedtoantibacterialsubstancesofthestrainD~7,arandommutantlibrarywasconstructedusingTn5transposonmutationmethod,and10mutantswithreducedantimicrobialactivitytoFusariumoxysporumwereobtained・Bythemutantinsertionsiteanalysis,wefoundthattheTn5transposonin5mutantswereinsertedintothesamegene,whichencodedglucose-inhibiteddivisionproteinA(GidA),whiletheinsertionsitesoftheremaining5mutantswerelocatedondifferentgenes,andtheencodedproteinsincludedglycosyltransferase,typeIIsecretionsystemproteinandsoon.ItindicatedthatthereweremultiplegenesinvolvedintheantifungalactivityofstrainD-7.KeywordsBurkholderiacenocepacia；Antimicrobialactivity；Mutantgene洋伯克氏菌群(Burkholderiacepaciacomplex,简称Bcc)在自然环境中分布十分广泛，包括水、土壤和植物根际等［1,2］。Bcc是常见的植物根际促生细菌，具有生物固氮［3］、生物修复［4］和植物促生［5］等功能。Bcc对多种植物真菌病害如腐霉病、立枯病和枯萎病等具有明显的防治效果［6］。任嘉红等［7］发现，拮抗细菌毗咯伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)JK-SH007的抗菌粗蛋白可明显抑制金黄壳囊胞、拟茎点霉、七叶树壳梭砲3种杨树溃疡病病原真菌的生长。然而，该属的部分菌株也是人体的条件致病菌［8,9］,因此生产上直接利用活体菌株存在潜在的风险，目前对于洋葱伯克霍尔德氏菌的研究主要集中在抗菌物质的活性成分分析及合成相关基因上。RecA基因在Bcc菌株不同基因型以及同一基因型间的相似性极髙，不同基因型间相似性达94%〜95%,而在同一基因型中的不同Bcc菌株的相似性则高达98%〜99%,对长度为1041bp的RecA基因的阳性克隆扩增率一直很高，基于RecA基因构建的系统进化树的聚类分析能够很好地区分Bcc菌株的各个种[10]O洋葱伯克霍尔德氏菌致病因子(B.cepaciaepidemicstrainmarker,BCESM)和电缆式菌毛及相关黏附素(cablepili&adhesion,cblA)是Bcc临床菌株与人体致病菌相关的两个毒力基因[11,12],常被作为筛选人体条件致病菌的重要标志。BCESM基因中存在一个834bp的开放阅读框，即esmR[13],是Bcc菌株中发现的第一个毒力基因，与Bcc菌株的流行致病有关，因此该基因被认为可以用于初步区分致病菌株与非致病菌株。cblA基因是另一个用来鉴定致病性菌株的毒力基因，该基因存在于大多数流行致病...