硫酸氨基葡萄糖胶囊对兔膝关节软骨细胞凋亡影响观察［摘要］目的观察硫酸氨基葡萄糖胶囊对兔膝关节软骨细胞凋亡的影响，为临床应用其治疗膝关节骨关节炎提供参考。方法采用30只新西兰兔，随机分为药物组、对照组和正常组各10只。药物组、对照组通过手术造成右膝关节失稳型动物模型，造模1周始躯赶全部兔子行走，连续4周，药物组并连续给药8周。造模后12周末处死所有动物,取右膝关节内侧胫骨平台软骨组织，采用原位末端标记法检测软骨细胞凋亡率，数据经统计学处理。结果对照组软骨组织退变明显，细胞凋亡率(30.50±4.72)%；药物组软骨组织退变较轻，细胞凋亡率(16.61±2.14)%；正常组软骨组织正常。细胞凋亡率(4.67±1.85)%。各组间细胞凋亡率比较差异有高度统计学意义(P<0.01)o结论硫酸氨基葡萄糖胶囊可降低兔膝关节软骨细胞凋亡率，延缓软骨组织的退行性改变。［关键词］氨基葡萄糖；兔；膝关节；细胞凋亡；实验研究［中图分类号］R684.3［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2013)05(c)-0010-04口服硫酸氨基葡萄糖治疗膝关节骨关节炎型实验,从细胞组织形态学探讨硫酸氨基葡萄糖胶囊对兔膝（osteoarthritisoftheknee,简称膝OA）在我国较为普遍，欧洲风湿病协会和国际骨关节炎研究协会治疗膝关节骨性关节炎亦推荐应用硫酸氨基葡萄糖[1-2],然而也有国外学者认为“很少有证据表明，氨基葡萄糖能促进关节软骨功能恢复”[3]o为观察其作用效果，本试验通过膝0A动物模关节软骨细胞凋亡的影响，进而初步评价硫酸氨基葡萄糖胶囊在膝0A防治中可能发挥的作用，为临床治疗提供参考和理论依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物6月龄雌性新西兰兔30只，体重2.5-3.0kg,由广西中医药大学实验动物中心提供[实验动物使用许可证SYXK（桂）2003-0001]o1.1.2实验仪器脱水机（ASP300S型，德国Leica公司）;包埋机（EG1160型,德国Leica公司）；光学显微镜（CX31型，日本OLYMPUS公司）；切片机（RM2235型，德国Leica公司）；漂片、烤片机（CS-III型,孝感亚鹏公司）;图文分析系统（HMIAS-2000型，武汉千屏医学影像技术有限责任公司）。1.1.3实验药品硫酸氨基葡萄糖胶囊，规格每粒0.314g（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20041316）,TUNEL试剂盒（美国罗氏公司）。1.2实验方法1.2.1动物分组随机分为硫酸氨基葡萄糖胶囊（简称药物组）、模型对照组（简称对照组）、正常组共三组，每组10只动物。1.2.2造模药物组、对照组共20只兔均使用1%戊巴比妥钠3mL/kg,兔耳缘静脉注射，参照改良Huith法的造模方法，于无菌条件下切断兔右膝内侧副韧带、前后交叉韧带及切除内侧半月板，缝合伤口，无菌敷料复盖，术后连用3d青霉素钠（每天5万U/kg）.链霉素（每天10万U/kg）o术后1周始躯赶兔子每天行走2次，共30min,连续4周。1.2.3给药根据Meeh-Rubner公式计算，药物组给予硫酸氨基葡萄糖胶囊每只0.628g/d,用生理盐水配成30mL液体灌喂，连用8周；对照组和正常组每日30niL生理盐水灌喂，连用8周。所有动物单笼饲养，饲养至4周时药物组、对照组各有1只兔子死亡，正常组有3只兔子死亡，予以剔除。造模后12周末分别处死所有动物。1.2.4取材所有动物于造模后12周末取材。耳缘静脉空气栓塞处死，解剖右膝关节，肉眼观察关节软骨组织大体变化，后使用咬骨钳、手术刀取内侧胫骨平台软骨组织放入4%多聚甲醛中备检。1.2.5指标检测1.2.5.1HE染色右膝内侧胫骨平台4%多聚甲醛固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，连续切片（厚度3um）,苏木精-伊红染色，封片，光镜下观察软骨形态变化。1.2.5.2原位末端标记法检测软骨细胞凋亡率切片常规脱腊至水，用蛋白酶K室温孵育30min,PBS洗2次，滴加50uL的TUNEL反应混合液，在湿盒中37°C孵育60min（为防止蒸发和保证TUNEL反应混合物均匀分布,在孵育过程中加盖盖玻片），PBS冲洗3次。擦干样品周围水分，加入50uL转化剂P0D,在湿盒中371孵育30min（为防止蒸发和保证转化剂POD（辣根过氧化物酶）均匀分布，在孵育过程中加盖玻片）。PBS冲洗3次，加入100nLDAB底物溶液，室温孵育10min,PBS冲洗3次，封片。在光学显微镜下观察，以细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性细胞（即凋亡细胞）。每个标本选择细胞分布较均...