烟草原生质体活力检测和细胞核染色方法的研究黄静1赵琦1李楠1赵玉锦2张世煌2(1首都师范大学生命科学学院,北京100037;2中国农科院作物科学研究所玉米研究中心,北京100081摘要本试验以烟草叶片和烟草悬浮系制备的原生质体为材料,采用不同染料对原生质体活力和细胞核进行染色效果比较.结果表明,原生质体活力观察宜采用荧光素双醋酸酯(FDA染色法,染色效果清晰易于观察,四嘧唑蓝(MTT法则可定量反映原生质体活力;相对于其他细胞核染料,DAPI对不同的原生质体细胞核染色效果均较好,能够清晰地对原生质体进行观察和计数.本研究为今后原生质体的检测提供有用的参考.关键词:烟草,原生质体,细胞核,染色.:Q94215收稿日期:2006209204原生质体(protoplast是去除细胞壁,裹的裸露细胞.障,、、细胞分裂与分化、、病毒侵染机理等基础理论的研究,同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础[1].目前植物细胞电融合技术不仅是植物遗传改良的重要手段,也是空间发展的生物技术之一[2].确定一套简便,准确的方法来研究原生质体活力及细胞核计数方法,对于观察原生质体的电融合具有十分重要的意义.本试验以烟草叶片和烟草悬浮系制备的原生质体为材料,采用不同染料对两种原生质体活力及细胞核计数方法进行了分析与比较,为今后原生质体的检测提供有用的参考.1材料与方法111材料烟草无菌苗(Nicotianatabacumcv.Wisconsin38叶片和烟草悬浮系(T2BY22为材料游离纯化得到的原生质体.112原生质体活力测定11211荧光素双醋酸酯(FDA和台盼兰染色法L丙酮溶液,4℃保存,工作0101%;台盼兰用磷酸缓冲液PBS(NaCl8100g/L,KCl0.20g/L,NA2HPO4・12H2O2189g/L,NAH2PO40120g/L,pH714配制为014%的工作液保存.吸取纯化的原生质体悬浮液015mL于1mL试管中,加入染料混匀,避光置室温5min,台盼兰用PBS清洗2次后在明视野显微镜下观察;FDA用荧光显微镜中蓝色激发块(B激发直接观察.11212四嘧唑蓝(Thiazolylblue,MTT染色法用磷酸缓冲液PBS配制5mg/mLMTT溶液,0122μm微孔滤器除菌,4℃保存,两周内有效.纯化的原生质体悬浮液中加入40μL的MTT染液,28℃避光保温4h,吸弃上清液,加入150μLDMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解,酶联免疫仪490nm进行检测.113原生质体细胞核计数11311罗丹明B(RhodamineB染色配制011mg/mL罗丹明B水溶液保存备用.使用时用017mol甘露醇溶液稀释10倍,吸取纯化的原生质体悬浮液015mL和100μL稀释染料于1mL试管中混匀,室温避光放置5min,用017mol甘露醇溶液清洗2次,显微镜下观察.11312苏木精染色本试验采用的是Carazzi苏木素染液.115g苏木素用5mL无水乙醇溶解,400mL蒸馏水溶解20g24第28卷第4期2007年8月首都师范大学学报(自然科学版JournalofCapitalNormalUniversity(NaturalScienceEditionNo.8Aug.,2007硫酸铝钾(加温至90,℃勿煮沸,将溶解的苏木素和碘酸钠同时加入硫酸铝钾水溶液中,流水冷却至室温,再加100mL甘油,振荡1h,染液可保存6个月.将纯化的原生质体悬浮液015mL和100μL苏木素染液置1mL试管中混匀,染色2min,用017mol甘露醇溶液清洗2次,在明视野显微镜下观察.11313吖啶橙(AcridineOrange,A0染色用蒸馏水配制成011%的吖啶橙储存液,置棕色瓶4℃保存备用.用前1mL吖啶橙储存液加pH418磷酸缓冲液9mL,配制成0101%吖啶橙酸染液.在纯化的原生质体中加入95%乙醇固定15~30min,用pH418磷酸盐缓冲液清洗;再加入0101%的吖啶橙染液,染色5~10min,pH418磷酸盐缓冲液清洗,用荧光显微镜蓝色激发块(B激发进行观察.11314DAPI(4′,62联脒222苯基吲哚染色将纯化的原生质体溶液用无水甲醇固定15~30min,PBS(pH7.4清洗2次,1μg/mL的DAPI溶液染色,避光放置10min,PBS(pH714清洗2,显微镜弱蓝光紫外(U激发激发块观察.2结果与分析211原生质体活力测定21111FDA染色和台盼兰染色FDA染色后发黄绿色荧光的原生质体为有活力的,红色荧光(叶绿素产生则表示死亡[3].荧光显微镜下观察到大部分烟草原生质体发黄绿色荧光,只有少数原生质体发红色荧光,染色清晰.台盼兰染液能够通过死亡细胞膜而使死细胞染成蓝色,但染料不能透过活细胞,因此活细胞不被着色.明视野显微镜下可以看到有活力的烟草叶片原生质体未被染色,为淡绿色,而失去内涵物的原生质体被明显的染成了淡蓝色,一...