用mRNA差异显示法寻找人绒毛膜上皮癌与孕早期绒毛组织间的差异基因【摘要】目的寻找人绒毛膜上皮癌(JAR)与孕早期绒毛组织间的差异基因。方法采用mRNA差异显示法(mRNAdifferentialdisplayPCR,DD-PCR)，即分别提取正常孕早期绒毛及绒毛膜上皮癌的总RNA，在oligodT15作用下分别合成相应的cDNA，并以其为模板利用试剂盒中的20对引物组合和α-32PdATP，Taq酶等进行PCR，将两者的PCR产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)上电泳，放射自显影后寻找两者间的差异片段，回收差异片段进行二次PCR，对二次PCR产物先采用反杂交法初步筛选后再用NorthernBlot鉴定。结果从PAG上切下32条差异条带，经反杂交初步筛选出11个阳性片段，对11个阳性片段分别做NorthernBlot鉴定，其中1个片段(T26)的基因长度约1.2kb，其在绒毛膜上皮癌中的表达远高于正常绒毛组织。结论T26基因片段可能是绒癌相关基因。【关键词】mRNA差异显示法(DD-PCR)；绒毛膜上皮癌(JAR)；绒毛；人【中分类号】R737.33【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-mRNADIFFERENTIALDISPLAYPOLYMERASECHAINREACTIONWASUSEDTOIDENTIFYDIFFERENTIALGENESBETWEENCHORIOCARCINOMAANDTHEFIRSTTRIMESTERVILLITISSUEINHUMANSHIGui-zhiGAOYing-mao（DepartmentofHistologyandEmbryologyofShandongMedicalUniversity,Jinan250012）GUXiao-songLIUMei（DepartmentofNeuroscienceInstituteofNantongMedicalUniversity,Nantong226001,China）WANGBao-heng（DepartmentofTechnologyofHighPeople'sCourtofShandongProvince,Jinan250014,China）【Abstract】ObjectiveToidentifydifferentialgenesbetweenchoriocarcinomaandthefirsttrimestervillitissueinhuman.MethodsmRNAdifferentialdisplayPCR(DD-PCR)wasused.FirstbothtotalRNAswereisolatedandreverselytranscribedintocDNAsrespectivelywitholigodT15,thenthesecDNAsweregonethroughPCRbyusingprimerpairsfromDeltaTMDifferentialDisplaykit,α-32PdATPandTaqDNAPolymerase.TheproductsofPCRwererunon6%denaturingpolyacrylamidegels(PAG)andautoradiogramswereexaminedtofindthedifferentialbandsbetweenbothgels.ThedifferentialbandswerereamplifiedusingthesamePCRconditionasbefore.ReversedotblotproceduresandNorthernanalysiswereusedtoidentifythebands.ResultsFromPAG32differentialbandsofchoriocarcinomawerecut,fromwhich11bandswereidentifiedthroughreversedotblotprocedure.Northernanalysisshowedthatoneband(T26)wasmuchstrongerinchoriocarcinomathaninnormalvilli,itsmRNAsizeisabout1.2kb.ConclusionDifferentialbandT26mayhaverelevancewithchoriocarcinoma.【Keywords】DD-PCR;Choriocarcinoma(JAR);Villi;Human胚胎孕早期绒毛滋养层细胞的发育与肿瘤细胞的增殖、分化及侵蚀性等方面有许多相似之处［1］。由于各种因素的影响，滋养层细胞过度增殖可恶化发展为绒毛膜上皮癌。目前对其发生机理尚不清楚。为了从分子水平上研究其致病机理，本研究采用近年发展起来的差异显示PCR技术［2］，比较了胚胎孕早期绒毛滋养层细胞与绒毛膜上皮癌(JAR)之间的基因表达差异，尤其是寻找肿瘤相关基因，进而对肿瘤的发生机理研究提供帮助。材料和方法1.标本来源正常孕早期胎盘绒毛组织(孕50d至60d，自停经算起)取自南通医学院附属医院人流室；绒毛膜上皮癌细胞株(JARcellline)购自上海细胞生物研究所。2.提取总RNA及电泳鉴定2.1提取总RNA：按TrizolTMReagent(GIBCO)说明进行。取100mg左右正常流产绒毛组织及培养的绒癌细胞，分别加入Trizol反应液1.5ml匀浆，室温静置5min，加入0.3ml氯仿，充分震荡15s，室温静置2min，12000×g4℃离心15min。取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10min，12000×g4℃离心10min，弃上清，加入1.5ml75%乙醇混旋沉淀，7500×g4℃离心5min，弃上清，晾干后，加入适量DEPC水溶解(65℃促溶15min)。测A260/A280，当比值大于1.7时进行下一步实验，以保证RNA的高纯度；根据A260值计算RNA含量，RNA含量(g/L)=A260×RNA稀释倍数×40mg/L÷1000。2.2RNA电泳：用1×甲醛...