红桂木凝集素的免疫调节作用初探李璐刘小芹曾麒燕(通讯作者)(广丙医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室广丙南宁530021)【摘要】目的研究红桂木凝集素(ALL)对小鼠的免疫调节作用。方法首先，在无菌条件下提取Balb/c小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，以重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmlL-4)协同诱导下培养，培养至第六天,添加TNF-a或者ALL继续培养两天。CCK-8法检测细胞增殖；倒置显微镜观察细胞生长变化;ELISA法测培养上清中IL-12、IFN-γ的分泌水平。其次，小鼠皮内注射OVA和/或ALL;两周后断尾取血，酶联免疫夹心法(EUSA)检测小鼠血清中OVA特异性IgG的浓度。结果ALL能显著促进小鼠骨髓来源树突状细胞(BmDC)的增殖；并促进BmDC分泌细胞因子IL-12、IFN-γ；但不能增强OVA在小鼠体内产生特异性抗体的量。结论ALL在细胞免疫中具有很好的促进BmDC成熟及增殖的作用，但不能增强小鼠对OVA的特异性体液免疫应答。【关键词】红桂木凝集素树突状细胞免疫调节【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2013)09-0074-02红桂木为桑科桂木属(波罗蜜属)植物，产于广东、海南、广两等地，药用只有活血通络，清热开胃，收敛止血的功效［1］。我教研室周德义教授等通过对植物种子进行筛选，首次发现桂木种子含有丰富的能使兔、羊和豚鼠等动物的红细胞和人红细胞强烈凝集的凝集素，并做了较系统的基础研究［2］。红桂木凝集素(artocarpuslingnanensislectin)是一种性质稳定、凝集活性高的植物凝集素。木课题组前期研究发现ALL能有效抑制急性淋巴细胞白血病jurkatT细胞的生长［3］,且能有效促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖［4］。树突状细胞是目前发现的体内最强的抗原提呈细胞，能激活初始T细胞，在诱导特异性免疫过程中起着重要作用［5］。树突状细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系。为了更好的研宄ALL的免疫调节作用，在本实验中，以Balb/c小鼠为研究对象，用ALL刺激BmDC,观察ALL对BmDC生长的影响;并检测IL-12、IFN-γ水平；体内实验以卵清蛋白(ovalbumin,OVA)为抗原，对Balb/c小鼠皮内接种免疫，观察ALL能否增强OVA的免疫效果。1材料与方法1.1实验小鼠：Balb/c小鼠，雄性，4-6周龄，广西医科大学实验动物中心提供。1.2试剂与仪器：红桂木种子，釆自广西药用植物研究所；ALL由本实验室自行提取；RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清(FCS)、青-链霉素双抗，购于美国Hyclone公司；重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmlL-4),购于美国PeprotechEC公司；细胞增殖检测试剂盒(cellcOuningkit-8,CCK-8),购于碧云天生物技术研究所；红细胞裂解液，购于solarbio公司;卵清蛋白(OVA),购于sigma公司;辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠白细胞介素-12/P40(IL-12/P40)、γ干扰素(IFN-γ)ELISA定量测试剂盒，购于R&D。1.3实验方法1.3.1BmDC的分离和培养：无菌条件下分离小鼠股骨和胫骨，用RPMI1640冲洗出骨髓细胞，吹打细胞悬液，4°C,1300rpm/min离心5min,弃去上清。加入3-5ml红细胞裂解液，置冰上3min,RPMI1640洗细胞两次，将细胞用含15ng/ml的rmGM-CSF、15ng/ml的rmlL-4、10%FCS和1%双抗的RPMI1640培养基(完全培养基)悬浮后，用(100×20mm)培养皿培养，置于37°C,5%CO2培养箱中，隔天半量换液。1.3.2ALL对BmDC生长的影响：按照上述培养方法培养至第六天，将细胞悬液分至96孔细胞培养板中(每孔lOOul，每组5个复孔)做如下分组：①ALL组:加入ALL使其终浓度分别为22.5ug/ml、90ug/ml、225ug/ml。②TNF-α组：加入TNF-α使其终浓度为50ng/ml。③对照组：加入等体积RPMI1640。培养48h后。倒置显微镜下观察各组细胞并于培养结束前3h加入CCK-8,每孔lOul,孵育3h后于酶标仪450nm处测吸光度值。计算增殖率。1.3.3ALL对BmDC分泌IL-12、IFN-γ的影响：按照1.3.2方法培养，每组均设3个复孔，至第八天收集细胞上清液。ELISA法检测细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ水平。1.3.4小鼠皮内OVA免疫：将Balb/c小鼠随机分为3组，每组4只，分别...