预防兽医学专业毕业论文[精品论文]反向遗传技术研究新城疫病毒P基因功能及其对病毒毒力的影响关键词：禽类新城疫病毒反向遗传P基因V蛋白C端结构域顺序编码摘要：新城疫(Newcastledisease，ND)是一种严重的传染性疾病，能够感染多种禽类，给世界养禽业造成了巨大的损失。测定了鹅源NDV强毒株ZJ1的全基因组序列，并在此基础上构建了该基因组cDNA的全长克隆以及分别表达该毒株NP、P以及L蛋白的3个真核表达质粒，通过病毒的体外包装技术，拯救出了具有感染性的病毒粒子，成功建立了鹅源NDV的反向遗传操作技术平台，这也为从病毒生物学特性的角度研究P基因提供了技术支持。1.基因III型和IX型新城疫病毒全基因组测序及其在新城疫进化史中的重要地位分析根据EMBL/GenBank中已发表的基因III型NDV全基因和基因IX型NDV基因片段设计一套全基因引物，将NDV全基因分为10个相互重叠的片段进行RT-PCR扩增。PCR产物连入pGEM-Teasy载体测序后应用DNAStar软件进行遗传进化分析。我们测定了5株基因IX型NDV和2株基因III型全基因组序列并进行遗传进化分析。实验数据显示，虽然两种基因型毒株同源性较高，但是基因IX型NDVNP基因内确实存在6nt插入片段，基因全长为15，192nt，是与基因III型NDV不同的毒株。鉴于基因IX型代表株F48E8的分离时间，可以确定早在上世纪三、四十年代就已经存在全长15，192nt的毒株。值得注意的是，常用的遗传进化分析以及限制性内切酶位点(RE)分析并不能有效的区分这两种基因型以及IV型，NP基因5’端非编码区核苷酸长度才是最可靠的遗传标志。最后，根据两个基因型毒株相近的分离时间和高度的同源性，我们推测最早有一群NDV毒株在遗传进化过程中分化为两支，保持15，186nt基因组长度的一支演变为基因III型、IV型及相关毒株；而另外一支，在NP基因5’-NCR插入6个核苷酸，产生了15，192nt基因组长度的毒株，可能即为最早的基因IX型毒株，再逐步进化演变为后来的基因V～VIII型。2.新城疫病毒P/V/W基因编码产物的结构域分析及针对V蛋白C端结构域的抗体制备根据EMBL/GenBank上发布的NDV基因序列，分别设计针对基因II、III、VI和VII型以及classINDV毒株P基因的引物。RT-PCR扩增后测序，从而获得5种基因型NDVP基因的正确序列。通过核苷酸序列预测P基因表达产物的氨基酸序列，并进行二级结构预测和三级结构模拟。实验结果发现，腮腺炎病毒属的猴副流感病毒V型(Simianvirus5，SV5)的V蛋白与NDVV蛋白的氨基酸序列同源性以及二级结构的相似性均较高，可以将其空间结构作为模板模拟NDVV蛋白以及P蛋白N端的空间结构。综合各种分析数据，可以确定P蛋白辅助N蛋白折叠的结构域位于N端前50aa内，其中20aa-29aa预测为一个潜在的疏水性α-螺旋；50aa-131aa结构紊乱；预测P蛋白螺旋卷曲结构位于221aa-290aa范围内，可能介导了P蛋白四聚体的形成以及与L蛋白的相互作用：预测NDV的X结构域位于291aa-392aa范围内，其中350aa-392aa区域内存在3个相连的α-螺旋，其二级结构与副粘病毒X结构域的C端亚单位结构相似，可能介导了P蛋白与衣壳化基因组的相互作用。V蛋白的C端结构域(C-terminaldomain，CTD)的编码区域位于P蛋白132aa-239aa区域内，与螺旋卷曲结构部分重叠。最后，根据分析结果将基因VII型NDV毒株ZJ1V蛋白CTD的序列插入pGEX-6p-1表达载体中诱导表达。表达产物通过切胶免疫的方法多次免疫小鼠，结果获得抗V蛋白CTD的多抗血清。利用间接免疫荧光鉴定多抗血清与病毒蛋白的反应情况，证明制备的抗CTD血清能够与NDV---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---感染vero细胞作用，与正常Vero细胞不反应，为后续的研究工作奠定了基础。3.不同基因型新城疫病毒P基因对病毒毒力的影响利用BglII酶切全长质粒pNDV/ZJ1，成功构建含有TVT载体、NP基因、P基因以及很少部分M基因和L基因片段的中间质粒pTX37。PCR分别分别扩增NDV基因II型疫苗株LaSota、基因III型中等毒力株JS/05/9/Go和基因VII型强毒株JS/05/5/Go的P基因，上游引物突变引入SmaI的酶切位点，下游引物突变出ApaI酶切位点。通过SmaI和ApaI将3株病毒的P基因替换进入中间载体pTX37，再利用Bst217I和XbaI将重组...