响应曲面法用于优化MTT实验条件的研究#宋春敬1，黄莹莹2，何易3，范英昌3**（1.天津中医药大学实验教学部；510152025303540452.天津中医药大学中药学院；3.天津中医药大学中医学院）摘要：目的：MTT法虽然被普遍使用，但是一直没有一个最佳添加量的考察，本文旨在研究MTT方法中MTT及DMSO的最佳添加量，以减少实验误差提高其灵敏度。方法：本实验以响应曲面法在96孔板中对MSCs的不同细胞密度、MTT添加量、DMSO添加量进行研究。结果：吸光度和细胞浓度、MTT加入量和DMSO加入量三个因素以及它们的交互关系都有显著的相关性，在490nm下当细胞浓度60000个/孔，加入MTT为156.3636ul，加入的DMSO为156.3636ul，OD值可以达到0.2839。在570nm下细胞的浓度为60000个/孔，MTT为165.4545ul，DMSO为167.6768ul，可以达到吸光值0.6513。结论：MTT实验最好在570nm下检测，稀释后的MTT（即0.5mg/ml）加入量为165.4545ul，DMSO的加入量为167.6768ul。关键词：中西医结合医学；MTT；二甲基亚砜；响应曲面法中图分类号：R2031ResearchontheoptimizingexperimentalconditionsofMTTassayusingresponsesurfacemethodologySONGChunjing1,HUANGYingying2,HEYi3,FANYingchang3(1.DepartmentofExperimentalTeaching,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine;2.ChineseMateriaMedicCollege,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine;3.ChineseMedicalCollege,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine)Abstract:MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazoliumbromide)assayhasbeenwidelyusedtoexaminethecellviabilityandinvitrocytotoxicity,howeverthereisnostudytooptimizetheworkingconditions.Theaimofthispaperistostudytheoptimumamountofreactivereagent(MTT)andformazanproductdissolventDMSOintheMTTassaytoreducetheexperimentalerrorandimproveitssensitivity.Method:Inthisstudy,theresponsesurfacemethodologyisusedin96-wellplatetoassessthecelldensitiesofmesenchymalStemCells(MSCs)andtheoptimumcontentofMTTandDMSO.Result:Theabsorbanceisstronglycorrelatedwith3factors,thecelldensity,theaddedamountofMTTandtheaddedamountofDMSO.At490nm,whenthecelldensityis60,000/well,MTTis156.3636µlandDMSOis156.3636µl,theabsorbancevaluecanreach0.2839.Whereas,at570nm,whenthecelldensityis60,000cells/well,MTTis165.4545µlandDMSOis167.6768µl,theODvaluecanreach0.6513.Conclusion:OurresultsdemonstratethatthebestMTTassayconditionistomeasuretheabsorbanceat570nmandtheaddedamountofdilutedMTT(0.5mg/ml)is165.4545µlandDMSOis167.6768µl.Keywords:integrativemedicine；MTT；DMSO；responsesurfacemethodology(RSM)0引言MTT方法自Mosmann[1]于1983年首创以来得到广泛的应用[2]。虽然一些研究者做出了一定的改进[3-5]，但MTT及DMSO的加入量却一直没有一个最佳添加量的考察，因此，我们以骨髓间充质干细胞（MSCs）为模型，利用响应曲面的方法对MTT方法中MTT及DMSO的最佳添加量进行研究，以求最大限度地减少实验误差，以提高比色法的稳定性和灵敏度。基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20101210110004)作者简介：宋春敬(1978-),女,实验师,中西医结合通信联系人：范英昌(1951-),男，教授，病理学和中西医结合.fych@tjutcm.edu.cn-1-1材料与仪器1.1试剂与仪器MTT，sigma公司，用PBS配制为5mg/ml，实验时以全培稀释十倍后进行添加。二甲基亚砜（DMSO），Sigma公司。501.2酶标仪，美国biorad伯乐iMark酶标仪。细胞及其培养条件骨髓间充质干细胞，原代培养，取自Wistar大鼠，雄性，180g左右，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心，许可证号:SCXK(军)2009-003。传代后用第三代细胞进行实验。55细胞培养于10%小牛血清的L-DMEM中，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中。2方法2.1MTT比色测定法将一定数量的细胞接种于96孔培养板中，加入100ul培养液置于细胞培养箱中培养，根据细胞生长曲线[6]，待两天进入对数...