Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制田戈姜敏通讯作者新疆医科大学附属屮医医院国家屮医临床研究基地新疆乌鲁木齐830000【摘要】目的：研宄Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况，探讨Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程屮的作用机制。方法：80只小鼠随机分成4组，分别熏烟2个月、四个月和6个月，应用Fenton反应，ELISA,Real-timePCR等方法检测抑制羟自由基能力、Nrf2、GSH、蛋白及Nrf2、&gamma;-GCSmRNA的表达，并行相关分析。结果：Fenton反应结果品示抑制释自由基能力在6个月熏烟组显著高于正常组(P<0.05)；ELISA结果显示熏烟各组血清屮GSH含量均高于对照组，其屮熏烟4个月GSH含量与对照组相比差异显著(P<0.05),熏烟6个月GSH含量与对照组相比差异极显著(P<0.01)；Real-timePCR结果显示熏烟各组&gamma;-GCSmRNA转求水平都高于正常组，其屮熏烟6个月组&gamma;-GCSmRNA水平昆著高于对照组(P<0.01);而Nrf2蛋闩及mRNA在各组表达无明显差异(P>0.05>;结论：过氧化物在熏烟各组小鼠肺组织屮累积，AT能通过活化Nrf2，促进Nrf2核积聚上调&gamma;-GCS的基因表达，在氧化失衡屮发挥作用。【关键词】慢性阻塞性肺病，氧化应激，Nrf2-ARE信号通路，&gamma;-谷氨酰半胱氨酸合酶【屮图分类号】R34【文献标识码】B【文章编号】1674-8999(2015)8-0187-02慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)是一种可预防、可治疗的疾病，以不完全可逆的气流受限为特点，呈进行性加重［1］。COPD发病机制尚未完全清楚，目前研究主要集屮在慢性炎症反应、蛋內酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激和上皮细胞凋亡等方面[2,3],氧化应激是造成COPD慢性全身损伤的重要原因。Nrf2-ARE防御性信号通路在抵抗内外界氧化应激反应，维持体内环境的稳定方面起到十分重要的作用。本实验拟通过香烟烟雾吸入法建立COPD的小鼠模型，并检测造模不冋吋间段Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况，探讨Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺病氧化失衡过程中的作用机制。1材料与方法1.1药物及试剂Elisa试剂盒均购置于武汉优尔生科技冇限公司，MouseNrf2ELISAKit,1Plate（货号SEL947HU）;MouseGSHELISAKit,1Plate（货号CEA294Ge）。1.2实验动物及模型建立清洁级雄性玷明小鼠80只，6〜8周龄，质量18〜20g,由新疆维吾尔自治区疾病控制中心提供。应用数字表法将动物随机分为正常组、熏烟2月组、熏烟4月组、熏烟6月组，每组20只。除正常组外，其余各组均使用自制熏烟箱进行熏烟，12支香烟/次，1日1次，每次lh，分别持续2,4,6个月，造模结束。因本实验完全复制前期COPD小鼠造模过程ii没有药物干预，所以死亡率很低,能确保实验顺利完成，造模结束后各组小鼠均为12只以上，符合统计要求。1.3标本采集和处理1.3.1肺组织匀浆收集：然后处死大鼠，取右肺50mg加入ImL冷生理盐水做肺组织匀浆，lOOOOrpm离心lOmin,上清液于-80°C冰箱保存；1.3.2血清收集：各组小鼠腹腔注射10%的水合氯醛0.3mL/100g以麻醉。麻醉后将小鼠仰面固定于手术台，75%酒精消毒皮肤后，打幵腹腔，使用一次性真空采血针行腹主动脉采血，采血针另一端连接非抗凝负压采血管，找到腹部动脉血管抽取小鼠动脉血于采血管内，37°C静置30min,3000rpm离心10分钟收集血清，分装后标记，-80°C保存备用。1.4测定肺组织匀浆中羟自由基OH-严格接照Fenton反应试剂盒说明书操作步骤进行羟自由基含量的测定。预实验确定肺组织匀浆合适的稀释浓度5%,反应后通过gress试剂显色，生成红色物质，lcm光径，550nm测吸光度值，计算公式为抑制释自由基能力（U/mgprot）=对照管吸光度-测定管吸光度标准管吸光度-空白管吸光度标准管浓度&divide;（蛋白毫克数/ml&times;取样量）1.5肺组织总RNA的提取及反转录将100mg肺组织于液氮中研磨，在液氮挥发完全前用DEPC处理过的不锈钢钥匙把粉状物转加入于ImL的Trizol裂解液中，并振荡混匀；然后样品置于离心机中4°C、10000r/min离心10min；将上清转移到处理过的新离心管，加入200&mu;L氯仿震荡混匀，并于室温静置5min后4°C、12000r/min离心15min；将上清转移到新的离心管，然后依次加入250&mu;L异...