一种竞争性RT-PCR测定HCVRNA方法的建立及其应用摘要：目的建立检测丙型肝炎病人血清HCVRNA水平的竞争性逆转录-聚合酶链式反应定量方法。方法采用含HCV5?非编码区(5?NCR)缺失突变的重组质粒5T1d?，将其目的基因亚克隆到体外转录载体pCDNAⅠ多克隆位点上，获得转录重组体5T1d?。将其线性化后用SP6RNA聚合酶体外转录竞争性缺失突变模板RNA，该模板定量后与血清HCVRNA一起作逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，建立检测血清HCVRNA水平的竞争性定量方法。结果检测15例丙肝病人20份血清，滴度为6.6×102～6.6×106copies/ml。结论各类丙型肝炎患者血清病毒滴度均较高，经干扰素治疗后病毒水平下降1～5个Log，年龄小于20岁者干扰素治疗效果较好。关键词：丙型肝炎病毒；竞争性逆转录-聚合酶链式反应；定量试验分类号：R446.1文献标识码：A：1001-8174(2000)03-0155-02DevelopmentandApplicationofaQuantitativeAssaybyCompetitiveRT-PCRtoMeasureSerumHCVRNAYANGCai-sheng，LIDong-liang,WENYun-hai,ZHANGGuo-an(The476thHospitalofPLA,Fuzhou350002,China)LUQiao-sheng(TheSouthHospitalofTheFirstMilitaryMedicalUniversity,Guangzhou510516,China)Abstract:ObjectiveToestablishquantitativeassaybycompetitiveRT-PCRmeasuringserumHCVRNAfrompatientswithHCVinfection.MethodAninvitrotranscriptionrecombinantplasmid5T1d?wasobtainedaftersubcloningthetargetgeneofclone5T1d,whichcontainedmutantHCV5?non-codingregioncDNA,intoatranscriptivevectorpCDNAⅠ.Afterlinearizationof5T1d?,recombinantRNAwassynthesizedusingSP6RNApolymerase.AcompetitiveRT-PCRassaywasestablishedbyco-amplificationHCVwildtypegenomeextractedfromserumandrecombinantRNA.ResultsTheHCVRNAtitersof20serafrom15caseswithhepatitisC,includingfivepatientstreatedwithalpha-interferon(IFN-α),weredetectedusingthismethod.ItwasfoundthatserumHCVRNAconcerntrationsrangedfrom6.6×102to6.6×106copies/ml.ConclusionsTherewerehightitersofHCVRNAinallkindsofpatientswithHCVinfection.InthefivepatientstreatedwithIFN-α,theserumconcentrationsdecreased1～5Log.TheeffectofIFN-αisbetterinpatientsyoungerthan20yearsold.KeyWords:HepatitisCvirus;CompetitiveRT-PCR;Quantatitiveassay丙型肝炎病毒(HCV)是肠道外传播非甲非乙型肝炎的重要病原，感染后很少自然缓解，病情较轻，进展缓慢，但预后严重，必须抗病毒治疗。检测血清HCV水平是丙型肝炎(HC)基础研究和考核疗效的重要手段。而其病毒血症水平极低，定量检测是目前HCV研究的困难之一。我们采用Kumar等［1］构建的HCV5’非编码区(5’NCR)缺失突变克隆，建立检测血清HCV的竞争性逆转录PCR(CRT-PCR)方法，初步观察丙肝病人自然状态和抗病毒治疗后的血清HCVRNA滴度变化。1材料与方法1.1研究对象15例HC患者，男9例，女6例，年龄16～71岁，根据1995年第五次全国传染病寄生虫会议修订的临床诊断标准，急性HC5例，慢性9例，亚急性重型1例。有输血史10例。全部病人经EIA或PCR试验已排除甲型和乙型肝炎病毒感染。血清标本于-20℃库存。1.2主要试剂TOP10F?菌株、转录载体pCDNAⅠ(Invitrogen公司)，含HCV5’NCRcDNA的缺失突变克隆5T1d(英国StMary’sHospitalMedicalSchool的UmeshKumar博士惠赠)，SP6RNA聚合酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶、无RNase污染的胰DNaseⅠ、rNTP、地高辛寡核苷酸加尾标记及检测试剂盒(BM公司)；TaqDNA聚合酶(上海复生生物工程研究所)；dNTP、AMV逆转录酶(Promega公司)；RNasin(华美生物工程公司)；引物由中国科学院上海细胞所合成，序列如下：外引物1985’CGGTTGGTGTTACGTTTG3’(反义)，1975’ATAGATCACTCCCCTGTG3’(正义)；内引物0385’GATGCACGGTCTACGAGACC3’(反义)，2475’CTTCACGCAGAAAGCGTC3’(正义)。1.35T1d目的基因的亚克隆Kumar等［1］设计的重组质粒5T1d，目的基因为人工缺失突变的5?NCRcDNA(173bp),将该目的基因亚克隆到转录截体pCDNAⅠ的BamHⅠ和EcoRⅠ位点上，所获新重组体用5T1d’表示。用EcoRⅠ和BamHⅠ...