人整合素分子α4亚基片段的克隆及大肠杆菌的表达［摘要］目的克隆并原核表达α4亚基片段。方法从IL-60细胞系中提取总RNA，以RT-PCR方法分两段扩增人整合素分子α4亚基片段2.0kbcDNA，将两片段连接，并将其中的1.7kb基因片段亚克隆至表达载体PGEX-KG中，IPTG诱导表达。结果RT-PCR扩增并克隆了α4的两段cDNA，序列分析表明：与文献报道的α4cDNA序列基本一致。两片段成功连接后，将其中的1.7kb亚克隆至表达载体PGEX-KG中，经诱导在大肠杆菌中得到高效表达。结论获得了α4亚基2.0kbcDNA片段，及其中1.7kb的原核表达产物对于研究α4整合素的功能有重要意义。［关键词］整合素；α4亚基；RT-PCR；cDNA克隆［中分类号］R392.11［文献标识码］A［］1000-8861（2000）03-0182-04Cloningofthefragmentofα4subunitofhumanintegrinandit’sexpressionfromE.coliLIUYong-quan，GAO激e-ying，PENGHong，LUOZheng-ge，MEIJun-激e（DepartmentofImmunology，InstituteofMicrobiologyandEpidemiology，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Bei激ng100850，China）［Abstract］ObjectiveTocloneandexpressthefragmentofα4subunit.MethodsThe2.0kbcNDAofhumanintegrinα4subunitfragmentwasamplifiedfromHL-60totalRNAbyRT-PCRastwoseperatesegments，afterthetwosegmentswerelinkedtogether，1.7kbofitwassubclonedintoexpressionvectorPGEX-KGandinducedbyIPTG.ResulstThesequenceofourcDNAisidenticalwiththereportedα4cDNA.Thenthetwosegmentswerelinkedtogether，and1.7kbofitwassubclonedintoexpressionvectorPGEX-KG.Theα4fragmentwasoverexpressedbyE.coliafterinducingwithIPTG.ConclusionThe2.0kbcDNAfragmentofα4subunit.wasobtained，and1.7kbofitwasoverexpressedbyE.coil，it’sveryimportanttostudythefunctionofα4integrins.［Keywords］Integrin；α4subunit；RT-PCR；cDNAcloning整合素是由α和β亚基通过非共价连接而形成的一类异二聚体，目前已发现20多种。其中α4整合素有α4β1和α4β7两种。前者主要介导淋巴细胞向炎症部位的迁移和聚集，从而在多种病理反应如实验诱导性脑脊髓炎、变态反应性哮喘等多种疾病中发挥重要作用。后者主要介导淋巴细胞向粘膜部位的迁移和归巢，并对该部位的免疫应答起关键作用［1］。抗α4的多种单克隆抗体可有效阻断α4整合素介导的多种反应，这些单抗所对应的抗原表位主要集中在α4N端1-500氨基酸残基区域［2］。α4的cDNA长达3.1kb，本文用RT-PCR方法分两段扩增了其中不带信号肽的2.0kb，并将其中的1.7kb克隆入表达载体PGEX-KG，在大肠杆菌中得到高效表达。由于表达产物完全包括了α4N端500个氨基酸残基，因此应当包含α4的主要抗原表位。1材料与方法1.1主要材料HL-60细胞由何福初教授惠赠；M-MLV反转录酶、PGEM-T载体购自Promega公司；TaqDNA多聚酶、限制性内切酶EcoRI、HindⅢ、PstI、XbaI、XhoI、异硫氰酸胍购自华美公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；焦磷酸二乙酯（DEPC）为Sigma公司产品。1.2总RAN提取异硫氰酸胍一步法提取总RNA［3］。1.3引物设计与合成根据文献报道的人整合素分子α4亚基cDNA序列［4］，设计并合成四条引物，分两段（830bp、1200bp）扩增无信号肽的α42.0kbcDNA片段。在引物5’端引入酶切位点XbaI、HindⅢ、PstI使扩增片段易于克隆，其中的HindⅢ是扩增片段内的酶切位点，以方便A、B两段的连接（见1）。1α4片段cDNA的克隆Fig1Cloningofα4fragmentcDNAP1＝GCTCTAGACTACAACGTGGACACTGAGAP2＝GTACGATCCAAGCTTTTTACCTTTCP3＝GGTAAAAAGCTTGGATCGTACP4＝GCCAATACTGCAGTCAAGTTGTAC1.4RT-PCR、片段克隆及序列分析以提取的总RNA为模板，以oligodT为下游引物，参照M-MLV反转录酶产品说明进行反转录。以反转录产物为模板，分别以P1、P2；P3、P4为引物扩增A、B段（见1）。PCR条件为：94°C变性30s，56°C退火1min，72°C延伸1min，共30个循环，最后72°C延伸10min。然后回收PCR产物，将A段按照产品说明书连入PGEM-T载体；B段经HindⅢ／PstI酶切连入经同样处理的pBSM13载体。由赛百胜公司分别对两段进行序列分析。1.5...