1材料与方法1．1材料1．1．1茵样菌样采自湖南、广东、广西和云南等四省(区)的12县(市)，包括原始森林中的腐烂树叶、剑麻土、甘蔗渣、酒醪、塘泥、污水、稍微腐烂的水果和蔬菜等；对照菌株(CK)为市售的丹宝利高温活性干酵母。1．1．2试剂和工艺辅料主要化学试剂有：无水葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、11℃(三苯基四氮唑盐酸盐)、氢氧化钠溶液、盐酸和硫酸等，这些物质均为市售商品。1．1．3培养基富集培养基：YPD液体培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)，自然pH；种子培养液：YPD液体培养基；平板分离培养基：YPD琼脂、PDA；初筛培养基：TIC上层培养基，TTC0．059、葡萄糖0．59、琼脂0．59、加入100mL无菌水；Trc下层培养基，YPD琼脂；发酵培养基(YFM)：150r：／L的葡萄糖，0．5％酵母膏，pH值5．o；斜面保藏培养基：YPD琼脂。1．2方法1．2．1样品处理称取固体菌样309左右，加入300mL无菌水中，120r／min摇10rain，两层纱布过滤，收集滤液备用；液体菌样不处理，直接用于富集培养。1．2．2富集培养取菌液10ml加入盛有富集培养基的锥形三角瓶中，添加适量的青霉素0．1％俨0．5％棚1制细菌的生长，于30。C恒温培养箱中培养2d，再取lml进行同条件传代培养，每2d接种继代1次，3次继代后进行分离纯化。1．2．3分离纯化将稀释的富集培养液，涂布于分离培养基平板上，置于30。C恒温培养箱中培养2d，挑取典型酵母菌落至YPD琼脂斜面，编号、培养，性能鉴定后将酵母菌划线分纯、保藏。1．2．4酵母茵的初筛利用产酒精能力强的酵母菌能还原三苯基四氮唑盐酸盐(TTC)变为深红色这一特性，筛选深红色菌落。将分离得到的各菌株依次接入Trc下层培养基的平皿中，培养24h，长出菌落后倒入TIC上层培养基，30。C下保温(阴暗处)2—3h。比较各菌株之间的产酒精能力，初筛出产酒精能力强的酵母菌株，将酵母菌接种于YPD琼脂斜面培养基中，低温保藏。1．2．5酵母茵的复筛将斜面菌种接一环于新鲜的种子培养液中，于30。C，170r／rain摇床培养24h。按10％接种量将菌种接入装有100ml发酵培养基(YFM)的三角瓶中，于35。C培养箱，静置发酵72h后测产气情况万方数据第3期彭源德等：耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定137和酒精含量。1．2．6诱变育种以复筛后的酵母菌为始发菌，接种于种子培养液培养12h后，通过高温(45℃)处理20min、调整菌悬液浓度为106个／ml，取5ml于无菌平皿中，进行紫外线处理(照射功率15w、照射距离20em、照射时间10min、杀伤率在99．99％以上)，然后对菌液进行分离、富培、纯化和菌株表型特征观察，菌体进行镜检。同时，对始发菌和诱变菌株进行乙醇发酵试验，发酵液起始葡萄糖浓度2009iL。1．2．7耐受性试验一般采用500ml锥形瓶盛培养液200ml，起始糖度为1509／l，接种量5％，自然pH，置35。C恒温静止培养72h，以丹宝利耐高温活性干酵母作对照，3次重复。根据研究目的设置的特定条件有：①耐热性：分别在30℃、35℃、40℃和45℃条件下发酵72h，测定发酵液的酒精浓度。②耐乙醇能力：分别设置种子液的乙醇起始浓度为o％、4％、8％、12％、16％和20％，于35℃恒温培养24h，观察菌种生长，在660hm下测定培养液消光值(OD)。③耐糖能力：分别设置发酵液糖的起始浓度为1509／1、2009／l、2509／1和3009／l，发酵72h，测定发酵液的酒精浓度。1．2．8测定方法酒精浓度采用酒精比重计法测定1121。2结果与讨论2．1酒精酵母菌的筛选酒精酵母菌的分离与筛选结果列于表1，从表中看出，采集的22个菌样中共分离出98个菌株，经初筛，获得12株酵母菌，占分离菌株的15．3％；酵母茵广泛分布于4省(市)12个县(市)的8类菌样中；经复筛，获得4株(编号分别为：Sll、S12、S15、S17)耐高温的酒精酵母菌株，它们分别来自腐烂树叶、甘蔗渣、剑麻土和酒醪等菌样。从不同温度下酵母菌的生长情况表2和表3可以看出，复筛出的4株酵母菌株均能在40℃下较好的生长，耐热性能与对照菌株丹宝利耐高温活性干酵母相当。表l酵母菌的分离与筛选结果抖：生长良好。+：生长较好，4-：弱的生长，一：不生长万方数据138中国麻业科学第32卷++：生长良好，+：生长较好。±：弱的生长。一：不生长2．2耐受性酵母茵的诱变育...