有关2型糖尿病相关炎症通路的研究DOI：10.16658/jki.1672-4062.2016.08.106[摘要]目的该文主要为了研究2型糖尿病患者外周血巨噬细胞中是否有ERK及STAT3通路的磷酸化激活。方法收集30例2型糖尿病患者及30名健康体检者的病例资料，提取两管肘静脉血。①离心收集上清液用ELISA法检验TNF-α及IL-6的分泌水平；②收集单核细胞，培养出巨噬细胞；③提取蛋白，Westernblot法检测ERK、p-ERK、STAT3及p-STAT3的表达情况。结果①与对照组比较而言，病例组中炎性因子TNF-α及IL-6的分泌显著增多，差异有统计学意义（P<0.05）；②糖尿病患者外周血巨噬细胞中普遍存在ERK及STAT3通路的磷酸化激活，但两种蛋白的总体表达水平却未见异常，半定量分析后发现，药物组中磷酸化蛋白/总蛋白的含量比值与对照组中两者比值比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论ERK及STAT3两条通路均参与了2型糖尿病的发病过程。[关键词]2型糖尿病；肿瘤坏死因子α；白介素6；p-ERK；p-STAT3[]R587.1[文献标识码]A[]1672-4062（2016）04（b）-0106-031实验材料及方法1.1收集病例、提取外周血收集病例资料，提取两管肘静脉血，淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞及单核细胞后换液，留存贴壁的单核细胞培养。1.2细胞培养1640培养细胞，每2～3d传代，待细胞贴壁达到90%左右时实验。1.3免疫荧光检测巨噬细胞96孔板培养细胞，甲醛固定，5%BSA封闭，加入CD11b过夜，二抗孵育，洗板，加入Hoechst染色剂2uL，荧光显微镜下观察。1.4ELISA检测TNF-α及IL-6的分泌按照TNF-α及IL-6的使用说明，在抗体包被的96孔板中加入标准样品及待测样本、生物标记二抗及酶标试剂，37℃反应1h，洗板，加显色剂，加终止液，酶标仪检测波长为450nm的光密度值。1.5Westernblot检测p-ERK、ERK、STAT3及p-STAT3的表达分别收集细胞，配制等体积等浓度的待测蛋白，配胶、电泳，冰上转膜，5%BSA封闭，敷一抗，4℃过夜，TBST洗膜，二抗孵育，ECL发光。1.6统计方法采用SPSS19.0及ImageJ软件进行统计学分析，数据用（x±s）表示，各组间的总体均值采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。2实验结果2.1免疫荧光结果见图1。荧光显微镜观察巨噬细胞为单层贴壁细胞，胞体细长呈梭形，发出较多分支。2.2ELISA检测炎症因子表达结果如下图2、图3。A：病例组，B：对照组：与对照组比较而言，病例组中炎性因子TNF-α分泌显著增高，组间比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。2.3Westernblot结果图4A。ERK及p-ERK条带图，如下图5A。STAT3及p-STAT3条带图，如下所示。3讨论超重是糖尿病的危险因素之一，而大部分降糖药物都会引起病人体重增加[4]。2型糖尿病是一种多基因遗传倾向性疾病[5]，目前已发现20多个候选基因与2型糖尿病有关联，目前世界许多国家都在致力于此方面的研究[6]，众所周知，炎症与2型糖尿病发病密切相关[7]，但与2型糖尿病相关的炎症通路目前研究不多，我们的研究正是基于这样的考虑，相信不久的将来会为我们防治或延缓2型糖尿病的发生提供理论依据。该实验首先通过ELISA法检测了炎性因子TNF-α及IL-6的分泌情况（见图2，图3），进而证实了炎症参与了2型糖尿病的发生及进展，接下来提取外周血单核细胞，并用CD11b对巨噬细胞进行特异性染色（如图1，a、b、c），证明巨噬细胞被成功提取，收集细胞，提取蛋白，Westernblot法检测ERK、p-ERK、STAT3及p-STAT3的蛋白分泌情况（图4a、4b、5a、5b），证明在2型糖尿病伴肥胖的患者中是否存在炎症通路ERK及STAT3的磷酸化激活。为糖尿病的诊断及治疗提供了新的治疗方向，临床意义深远。[参考文献][1]王蕾，罗坤年.2型糖尿病视网膜病变患者血脂与尿微量白蛋白的关系[J].上海医学检验杂志，2001，16（1）：24-25.[2]Rapoport，Ferreira.PD98059preventsneuritedegenerationinducedbyfibrillarbeta-amyloidinmaturehippocampalneurons[J].JournalofNeurochemistry，2000，74（1）：125-133.[3]CXTao，WNian-Song，FLi-Li，etal.-elecoxibinhibitsgrowthofhumanautosomaldominantpolycystickidneycyst-liningepithelialcellsthroughtheVEGF/Raf/MAPK/ERKsignalingpathway[J].MolecularBiologyReports[J].2012...