・13・第18卷第1期2005年1月医学研究生学报JournalofMedicalPostgraduatesVol.18No.1Jan.2005・论著・携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建成俊1,史晓峰1,谢森2,唐礼功2,夏穗生1(11华中科技大学同济医学院器官移植研究所,湖北武汉430030;21广州军区武汉总医院泌尿外科,湖北武汉430070)摘要:目的:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。方法:应用RT2PCR方法扩增人转化生长因子基因,与GFP真核表达载体连接,构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体,并用限制性内切酶酶切鉴定。结果:构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序,证实新质粒的构建成功。结论:应用RT2PCR方法扩增目的DNA片段,简单快捷;双酶切定向克隆可以保证构建一步到位,免去正反向重组体筛选的问题。关键词:转化生长因子;绿色荧光蛋白;真核表达;载体:Q782文献标识码:A:100828199(2005)0120013204Constructionofeukaryoticexpressionvectorcontaininggreenfluorescentproteinandβ1genehumantransforminggrowthfactor2CHENGJun1,SHIXiao2feng1,XIESen2,TANGLi2gong2,XIASui2sheng1(11InstituteofOrganTransplantation,Tong激Hospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,Hubei,China;21DepartmentofUrinarySurgery,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouCommand,Wuhan430070,Hubei,China)Abstract:Objective:Toconstructaneukaryoticexpressionvectorcarringgreenfluorescentproteinandhu2ββmantransforminggrowthfactor2forminggrowthfactor21gene.Methods:Humantrans1genewasamplifiedbyRT2PCR,linkagedwitheGFPeukaryoticexpressionvector,andthenidentifiedtherecombinantplasmidbyβrestrictionenzyme.Results:Therecombinantplasmidcarriedhuman2TGF21andGFPgenebyrestrictionenzymecuttinganalysisandDNAsequenceanalysisweresucceeded.Conclusion:ItissimpletoamplifyaimgenebyRT2PCRinonestep.Theorientationclonecanassuretherecombinantino---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---nestepandavoidscreeningobverse2inverserecombinant.Thenewkindofeukaryoticvectorcanserveasanewtoolandthemethodinthetransplantationarea.βKeywords:Transforminggrowthfactor2Greenfluorescentprotein;Eukaryoticexpression;Vector1;排斥反应或耐受的发生。T细胞在移植免疫起主导作用,免疫抑制性细胞因子转化生长因子(transform2ββinggrowthfactor21,TGF21)可抑制移植物的免疫损伤和耐受的形成1。此外,对供、受者间细胞迁移和0引言器官移植后会引起供受者间复杂的免疫应答,包括供受者免疫(非免疫)细胞的活化、迁移,可导致收稿日期:2004204214;修订日期:2004206204作者简介:成俊(19722),男,湖北道山人,医学博士,从事器官移植专业。・14・医学研究生学报2005年1月第18卷增殖周期变化的研究,可有效了解供者免疫系统的变化,标记特定的细胞有助于研究移植排斥和耐受。因此,我们构建携带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)人转化生长因子基因的真核表达载体,为器官移植的基因治疗和标记提供适合的载体系统。1材料和方法111材料和试剂DH5α菌株购于天为时代公司;BamHⅠ限制性内切酶,HinDⅢ限制性内切酶,T4DNA连接酶购于宝生物公司(TakaraBiotechnologyCo.,Ltd);GFP表达载体由同济医院泌尿外科郭新医师惠赠;RNA抽提试剂盒购于上海华舜公司,RT2PCR试剂盒和PCR引物由上海生工公司提供,其他均为国产试剂。112外周血单核细胞(PBMC)的收集和总RNA提取人抗凝血50ml,用淋巴细胞分离液梯度离心得到PBMC。采用酸性酚2硫氰酸胍2氯仿法提取细胞中的总RNA,异丙醇沉淀RNA,用去DEPC水溶解后紫外分光光度法定量,并于-70℃保存备用。113RT2PCR扩增人转化生长因子(hTGF2β1)cDNA根据文献2和Genbank提供的mRNA序列设计引物,primer1为oligo(dT),primer2正链引物5′2TAAGCTTACACCAGCCCTGTTCG23′,其5′端添加HinDⅢ酶切位点;primer3负链引物3′2ATTCCT2GTGGCACGGGGGATCCT25′,其5′端添加BamHⅠ酶切位点。以primer1合成cDNA,primer2和...