拓筑2009,35(3):91-93柑橘黄龙病nested-PCR检测技术在柑橘苗木生产中的应用陈传武I，白先进2,赵小龙"，付慧敏-邓崇岭吴初超】，王明召I(1.广西柑橘研究所，桂林541004；2.广西壮族自治区农业厅，南宁530022)摘要柑橘黄龙病(huanglongbing,HLB)是柑橘生产上的一种毁灭性病害。本研究以柑橘叶脉为材料，采用nes・ted-PCR技术对广西部分柑橘苗画苗木进行了黄龙病检测。结果表明，ncsted-PCR技术不仅可以检测已经表现症状的苗木样品•还可以检澆出带病但不显症的苗木样品。2007年共检测柑橘苗木样品1950个，2008年共检测样品1480个，黄龙病苗木检出率分别为10.31%和6.22%。本研究对及早控制带病苗木的传播，繁育柑橘无病毒苗木具有重要的意义。关键词柑橘；黄龙病；nested-PCR;苗木中图分类号：S436.661.11文献标识码：ADOI：10.3969力.issn.0529・1542.2009.03.023Nested-PCRdetectionofthecitrushuanglongbingdiseaseChenChuanwu1,BaiXianjin2,ZhaoXiaolong1,FuHuiniin1,DengChongling1,WuRengchao2,WangMingzhao1(I.(fuangxiCitrusResearchInstituteGuilin541004,China；2.AgricultureBureauofGuangiiZhuangAutonomousRegion»Nanning530022>China)AbstractThecitrushuanglongbing(HUB)isadestructivediseaseofcitrus.SomecitrusnurserytreesinGuangxiweredetectedwithnervationmaterialsbynestedIKSR.BothsymptomaticleavesandasymptomaticleaveswithHLBcouldproducepositivenested・PCRproducts.Onethousandninehundredandfiftynurserytreesand1480nurserytreesweredetectedduring2007—2008.TheincidenceofHLBdiseasewas10.31%and6.22%^respectively.AfastandreliablemethodforHLBpathogendetectionhasbeenestablished,whichmightplayanimportantroleinpreventingHLr^infectcdnurseryseedlingsfromspreading.Keywordscitrus；huanglongbing!nested-PCR；nurseryPlantProtection柑橘黄龙病(huanglongbing,HLB)是柑橘生产上的一种毁灭性病害。现在亚洲、非洲、大洋洲•南北美洲的40多个国家都有黄龙病发生。黄龙病病原菌为韧皮部杆菌(CandidatusIJberibact-cr),属于难培养细菌叮。迄今，该病原菌已发现3个种:即亚洲^(.CandidatusLibcribacterasiaticus)、美洲种(CandidatusLibcribacteramericanus)和非洲种(CandidatusLibcribacterafricanus)12，中国的黄龙病病原菌为亚洲种3：。近来也有报道称巴两发现有些黄龙病症状与植原体(phytoplasma)相羌，仝聖卷強空国发生严重，造成了巨收稿日期：2008-10-23修订日期：2008-12-07基金项目：广西自然科学曜金(桂科自0832187)*通讯作者Email：zxl00801@163.com大的经济损失，严重威胁着我国的柑橘产业。由于黄龙病症状有时与一些生理病害、病虫害症状相似,所以容易发生误判。而指示植物鉴定法则山于耗时长，厅地多，不适用于快速的大规模检测。20世纪90年代中期法国利用In2.6特征片断设计的儿对引物，建立了柑橘黄龙病病菌PCR检测方法,使运用PCR技术检测此类病害成为可能⑷。嵌套式聚合酶链式反应(nested-PCR)重复性好、检测成本低,灵敏度较常规PCR的灵敏度要高IO。倍左右⑺，适用于柑橘黄龙病的早期诊断及柑橘苗木的大规模检测。本研究采用nested-PCR技术对广西部分柑橘苗圃苗木进行了黄龙病检测，对及早控制带病苗木的传播繁育柑橘无病毒苗木具有重要的意义。1材料和方法1.1材料材料为广西各县市苗圃样品，以每苗圃每品种为单位,1万株以下采集10个样（10株），每增加1万株加采10个样。重点采集有疑似症状的叶片。对无症状植株采用对角线取样法，每条对角线等距取5个样,各苗圃分品种采样。每个样品采苗木中上部5片老熟叶。每个单株样品各放置一个保鲜袋中,每个品种或果园样品再统一放在翊料袋内，内放标签注明采样时间、地点、品种、接穗来源、苗圃所有人。采集后3个工作日内送至检测地。本试验中以柑橘叶脉为材料，以典型斑驳症状的黄龙病叶片为阳性对照，阴性对照采自广西柑橘研究所脱毒母本园。1.2引物Nested-P（：R引物根据柑橘黄龙病病原亚洲株系16SrDNA设计⑶，由上海生工生物工程冇限公司合成。其中nested-PCR外侧引物为P1:TGAATTCT...